寻找血友病的基因疗法被证明是困难的

 马丁从未学会骑自行车，不能和他的朋友们踢足球，并且在花园里玩耍时戴着头盔，以防万一碰伤头部。他的父母有充分的理由保护他：他患有严重的B型血友病，意味着最轻微的触碰都可能导致严重的、使人衰弱的出血。“患有血友病长大是非常令人沮丧的，”马丁说。“你想和其他孩子一样，但你不能。”

由于遗传基因突变，B型血友病患者缺乏一种名为凝血因子IX的蛋白质，这种蛋白质对于形成血凝块至关重要。目前，患者每周需要多次接受浓缩蛋白质的输注治疗。这可以止血，但不能解决疾病的根本原因，也不能完全消除其使人衰弱的症状。

几年前，马丁不得不停止他作为卡车司机的工作。“我让公司失望了，因为我无法去上班，”他说。“关节出血使我移动非常痛苦。” 2011年，在经历了37年的疼痛和内部出血引起的关节退化后，马丁在伦敦皇家自由医院报名参加了一项基因治疗临床试验，希望它能提供一些缓解。

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该疗法旨在让身体自行产生功能性凝血因子，而不是输注功能性凝血因子。含有功能性凝血因子IX基因的DNA被捆绑到病毒（称为AAV8）的分子外壳中，然后被输送到肝细胞中，凝血因子IX通常在那里产生。

在入组的六名患者中，有四名在治疗后能够停止输注治疗。马丁是其中之一：他的凝血因子IX水平显著增加，使他脱离了重度血友病患者的范围，进入了中度组。此后，他的凝血因子水平一直保持稳定。

对于爱德华·塔登汉姆（Edward Tuddenham）来说，这次成功是至关重要的一步，他是伦敦大学学院的血友病荣誉退休教授，也是该临床试验的负责人。他希望找到一种不仅针对B型血友病的疗法，而且也针对更常见的A型血友病的疗法——但这被证明是一个挑战。

言论自由
病毒载体AAV8是治疗B型血友病的理想选择，但对于A型血友病效果较差。这是因为编码A型血友病中缺失的凝血因子（凝血因子VIII）的DNA大约是凝血因子IX的六倍大，因此它不适合AAV8。为了使其适合，研究人员经常从凝血因子VIII基因序列中切除4500个碱基对。他们删除的部分编码了蛋白质的一个特定区域——称为B结构域——它确保凝血因子VIII的有效分泌。塔登汉姆和他的同事们尝试用一个大小为五十分之一的DNA序列代替它，但具有相同的功能。但在2010年对血友病小鼠的研究中，这些B结构域修饰的治疗方法并没有提高血液中凝血因子VIII的表达水平。从那时起，塔登汉姆不仅一直在尝试修复基因，还在努力提高其表达。

凝血因子VIII基因产生蛋白质的速率部分受到DNA碱基三联体（密码子）位置的影响，这些密码子决定了遗传物质翻译成蛋白质的起始和终止位置。正常小鼠或人凝血因子VIII基因的DNA序列中的起始和终止密码子并不能促进旺盛的蛋白质生产。“因此，我们用更好的密码子替换了它们，”塔登汉姆说。完成这项工作后，血友病小鼠模型中的表达水平从健康小鼠的约2%提高到约2000%。密码子优化产生的增加是“巨大的，真正令人震惊的”，他说。

2015年，塔登汉姆和他的团队希望领导试验，以测试他们优化的凝血因子VIII基因疗法对A型血友病患者的安全性和有效性。试验人数可能在10到20人之间，但即使凝血因子在人体内有效表达，仍然有障碍需要克服。

在血小板上递送
一个障碍是AAV8只能给药一次，因为该病毒会引发强烈的免疫反应。“用AAV8治疗一次后，你永远不能重复给药。你会对其产生免疫，”塔登汉姆说。因此，虽然基因疗法可能是一次性治愈，但如果在疗法到达目标之前免疫反应被触发，它就毫无用处。

威斯康星州密尔沃基市儿童医院研究所的大卫·威尔科克斯（David Wilcox）希望通过使用人体自身的细胞来递送凝血因子VIII来解决这个问题。他正在开发一种将功能性凝血因子VIII插入称为α-颗粒的结构中的方法，α-颗粒存在于称为血小板的血细胞内（见右图）。血小板是第一个到达伤口部位的细胞，它们通过释放化学信使迅速开始帮助形成血凝块。威尔科克斯正在努力改造血小板，使其也释放功能性凝血因子VIII。“这消除了AAV和凝血因子VIII蛋白质在身体其他部位漂浮的问题，”威尔科克斯说，“从而避免任何免疫反应。”

然而，首先，威尔科克斯必须从患者身上采集血干细胞。他使用生长因子诱导骨髓中的干细胞进入外周血管，在那里它们可以很容易地被收集。干细胞占外周血样本的2-5%，然后在称为外周血干细胞分离术的过程中分离出来，并进行基因治疗，使其包含功能性凝血因子VIII。然后，患者接受化疗以部分抑制其现有的骨髓干细胞，然后接受工程改造的干细胞输注到血液中。这些细胞会自行回到骨髓，在那里它们最终会产生含有功能性凝血因子VIII的血小板。

2013年，威尔科克斯使用人凝血因子VIII基因在三只患有严重A型血友病的狗身上测试了该程序——其中两只狗不再需要通常的输注凝血因子VIII治疗。正如预测的那样，没有一只狗显示出对人凝血因子VIII蛋白产生抗体的迹象——当狗被割伤时，血凝块的形成速度比没有基因治疗时更快。“我们认为凝血因子VIII在创伤部位从血小板中分泌得如此之快，以至于在凝血因子VIII开始修复血管损伤之前，免疫系统没有时间做出反应，”威尔科克斯说。与塔登汉姆一样，威尔科克斯的团队也希望明年开始临床试验。

但是，即使血小板可以提供另一种递送载体，对于患者来说，这可能也是一种令人不快的选择。“我认为他们为患有AAV抗体或受HIV和肝炎影响的患者提供了一种可行的方法，”塔登汉姆说，“但在干细胞移植前进行化疗的剂量并不轻松。”

就地纠正
到目前为止，基因治疗试验主要集中在患有该疾病的成年人身上，但血友病是一种遗传性疾病，从出生时就开始影响一个人。不幸的是，该技术对于儿童来说不是一个可行的选择。宾夕法尼亚州费城儿童医院的血液学家凯瑟琳·海（Katherine High）说，如果将含有通过AAV引入的凝血因子VIII基因输注到儿童的肝脏中，血液中凝血因子水平最初会增加，就像塔登汉姆2011年试验中的成年人一样。但是，随着儿童的成长，当产生不含功能性凝血因子VIII基因的新肝细胞时，表达水平会降低。

理论上，威尔科克斯的方法可能对儿童有效，因为功能性凝血因子基因已整合到干细胞的基因组中，并将传递给子细胞。然而，在实践中，没有负责任的医生会将患有非致命性疾病（如血友病）的婴儿或儿童暴露于化疗。

避免这些问题的一种有希望的方法是体内基因组编辑，其中突变基因在原位被纠正，而不是被替换。这可能在任何年龄段都有效——但这种治疗越早开始越好，因为益处将是终生的。

澳大利亚悉尼新南威尔士大学的梅林·克罗斯利（Merlin Crossley）说，从概念上讲，这种方法就像设置一个生物工具来切除基因组的突变区域，然后再设置另一个工具来插入校正后的模板一样简单。克罗斯利认为基因编辑疗法是治愈血友病的最佳潜在工具。

这可能对儿童尤其有益：随着肝脏的生长，新的子细胞将包含功能性凝血因子基因。然后，凝血因子将被识别为身体的一部分，并最终消除儿童的血友病。“替换模板是从健康患者克隆的，不会受到免疫系统的攻击，因为它不被认为是外来的，”克罗斯利说。

海在2011年对小鼠进行的一项研究提供了强有力的证据，证明基因组编辑是一种可行的选择。在出生后立即，一组小鼠接受了塔登汉姆风格的基因转移疗法；第二组小鼠接受了基因组编辑治疗。海发现，即使在手术切除部分肝脏后，接受基因组编辑治疗的小鼠体内功能性凝血蛋白的水平仍然很高；相比之下，在接受基因疗法的小鼠中，凝血因子水平下降了。“这是这种治疗方法的优势，特别是对于儿童，”海说。

基因组编辑必须精确地靶向要修复的突变，而A型血友病的突变数量之多——超过2000种——使这成为一个挑战。

海和塔登汉姆都认为，在短期内，基因组编辑不是答案。“从小鼠的概念验证实验到人类基因转移疗法的临床试验，间隔了14年，”海说。“在我们甚至考虑在成年人（更不用说婴儿）身上尝试基因编辑之前，我们还有很多关于大型动物基因编辑的知识要学习。”

将他的血友病程度降低到中度极大地改善了马丁的生活质量。自从基因治疗以来，他接受标准输注治疗的次数不到十次，并说“其中只有一次是严重的出血”。他说，报名参加试验并不是一个容易的决定，因为没有任何其他类似的试验可以作为他决策的依据。但他相信，他的成功经验应该有助于鼓励人们参与未来的研究。“你从一个知道自己是什么样的人，自己怎么样以及如何应对它的位置，到一个完全不确定的位置，”他说。“所以我希望，当其他患者听到我们的经历时，不确定性会降低。”

本文经许可转载，并于2014年11月26日首次发表