笹井芳树不仅仅是一位普通的组织工程师，他尝试诱导干细胞生长成完全成形的身体结构。的确，笹井通过承担重大项目而名声大噪，例如利用干细胞培养视网膜、皮质组织和小脑，这些都与平衡和运动有关。但是，他的研究更深入地探讨了干细胞如何在基因和产前环境的影响下组织成复杂的结构。请阅读此处对笹井的个人简介，以配合《大众科学》11月刊中笹井自己撰写的关于培养视网膜的文章“自己培养眼睛”。
来自《自然》杂志
2010年12月，罗宾·阿里突然对一项通常很平凡的科学论文评审工作感到兴奋。“我当时在房间里跑来跑去，挥舞着手稿，”他回忆道。这篇论文描述了一团胚胎干细胞如何生长成一个圆形的视网膜组织杯状体。这种被称为视杯的结构在发育中的胚胎中形成眼睛的后部。但是这个视杯是在培养皿中形成的，而且论文附带的视频显示该结构正在缓慢地萌发和绽放。对于在伦敦大学学院工作并致力于修复视力的眼科医生阿里来说，其意义是显而易见的。“对我来说，这显然是一篇里程碑式的论文，”他说。“他改变了这个领域。”
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“他”是笹井芳树，日本神户理化学研究所发育生物学中心的干细胞生物学家。笹井以其诱导神经干细胞生长成复杂结构的“园艺”天赋给许多研究人员留下了深刻的印象。除了视杯1，他还培养了大脑皮层的精细组织层2和一个基本的、产生激素的垂体3。他现在正在培养小脑4，小脑是协调运动和平衡的大脑结构。“这些论文是近年来最令人着迷的干细胞论文系列，”布鲁塞尔自由大学的干细胞科学家卢克·莱恩斯说。
笹井的工作不仅仅是组织工程：它解决了困扰发育生物学家数十年的问题。胚胎中不断增殖的干细胞是如何无缝地组织成身体和大脑的复杂结构的？组织形成是由细胞固有的遗传程序驱动的，还是由邻近组织的外部线索塑造的？通过将直觉与耐心的尝试结合起来，笹井发现这需要两者之间的微妙平衡：他构建了可控制的环境，为细胞提供物理和化学信号，但也让它们自由地“做自己的事”，并将自己组织成组织。他有时把自己比作一位日本媒人，他知道，把两个陌生人带到一起后，就需要让他们独处。“他们知道该怎么做，”他说。“它们以微妙的方式相互作用，如果外部线索太强，就会覆盖内部线索。”
笹井的工作可能会找到医学应用。事实证明，以三维形式再现胚胎发育，可以比二维培养更丰富、更有效地产生临床上有用的细胞，例如光感受器，并将其安置在与人体结构相对应的结构中。笹井和他的合作者现在正在竞相将实验室培养的视网膜植入小鼠、猴子和人体内。在笹井看来，在二维培养中成熟的干细胞可能会导致“下一代”疗法，但他的方法将导致“下下一代”疗法。
自我决定
笹井的动作有些僵硬，举止也比较保守，但他仍然在国际研讨会后他所在的研究所举办的派对上用鸡尾酒调酒器进行戏剧性的表演。“我的第二份工作是调酒师，”他面无表情地说。然而，正是他在96孔培养板中调制的鸡尾酒为他赢得了科学界的赞誉。
像他的许多家人一样，笹井也学习了医学。但他很快对该领域缺乏基础知识感到沮丧，尤其是在神经系统疾病方面。“不了解大脑，医生就无法为患者做太多事情，治疗方法也永远是肤浅的，”他回忆起当时的思考。似乎没有比研究大脑在胚胎中如何出现和折叠更好的方法来了解大脑了。“它很复杂，通常复杂的系统都是混乱的，”笹井说。“但它是最有秩序的系统之一。”他想知道这个精细的系统是如何被控制的。
谜题的一部分是众所周知的：斯佩曼组织者，脊椎动物胚胎中的一个节点，它诱导周围的细胞变成神经组织。自1924年被发现以来，该组织者是如何工作的仍然是一个谜；为了弄清楚这一点，笹井接受了在加州大学洛杉矶分校的博士后职位。当笹井在前往加州的途中在机场被抢走钱和护照时，这个职位的开端很艰难。但他的科学努力很快得到了回报。“他补办了护照，并在一个月内克隆出了使我们获得著名的chordin基因的基因，”他的主管，发育生物学家埃迪·德·罗伯蒂斯说。
笹井和他的同事发现，chordin蛋白是斯佩曼组织者释放的关键发育信号5。他们发现，chordin不是推动附近的细胞变成神经元，而是阻止那些将它们变成其他细胞类型的信号6,7。这项工作有助于建立神经诱导的默认模型：即在没有其他信号的情况下，胚胎细胞将遵循内部程序成为神经细胞的观点。
到20世纪90年代末，胚胎干细胞科学家也在研究这些信号。他们想把干细胞变成成熟的细胞类型——特别是神经元——这可能会导致疗法。笹井说，问题在于科学家通常“用力过猛，扰乱了系统”。笹井知道，在胚胎中，从系统中减去信号才是关键，而不是扰乱它。“我们试图最大限度地减少外部线索，”他说。
笹井围绕这一理念建立了一个实验系统。他抛弃了通常添加到生长中的胚胎干细胞中的血清，其中包含各种未经表征的生长因子和其他信号分子。他还去除了物理线索，例如与培养皿塑料表面的接触，允许胚胎干细胞自发形成漂浮的聚集体，称为胚状体。“如果它们被附着，它们就像囚犯一样，无法表达自己的意愿，”他说。在没有这些支持系统的情况下让细胞存活下来是一个挑战，但是经过五年仔细的实验后，笹井发表8并随后获得了他的无血清胚状体培养的专利——一个精简的生命支持系统，其中只包含恰到好处的成分混合物，供细胞存活。这将成为他的脑组织工厂的核心。
量身定制
在笹井的系统中，胚状体很快变成了他所谓的“脑球”——其中充满了神经前体细胞。笹井发现，完全不加干预的脑球会产生类似于发育中的大脑区域（称为下丘脑）中的细胞9，但那些只添加了一点生长因子的脑球开始分化成大脑皮层细胞2。当笹井培养这些细胞大约两周时，他得到了一个惊喜：皮层细胞自发地开始形成分层结构，最终与15天大的小鼠的皮层非常相似。当移植到新生小鼠的大脑中时，该结构存活了下来。“我们就是这样做的，”笹井说。“我们设置允许的条件，选择合适的培养基和细胞数量。但之后我们就什么也不做了。让它们继续生长，让它们做自己的工作。”
然而，实验室培养的皮层并不完美：例如，它只具有大脑皮层的六个细胞层中的四个。笹井认为视网膜——一种从胚胎大脑中长出的分层组织，其中包含感光光感受器——可能更容易培养。视网膜比皮层薄，在胚胎发育的早期形成，并且不需要复杂的血管系统。
为了使他的系统适应不同类型的组织，笹井对培养条件进行了微小的改变，这些改变将细胞推向发育的道路。他将荧光“报告基因”通过基因工程改造到干细胞中，以便当细胞分化成所需的类型（在本例中为视网膜前体细胞）时表达，并揭示系统是否正常工作。“我们的成功取决于了解细微的修改如何导致巨大的变化，”他说。
事实证明，培养视网膜只需要做一些调整，例如降低生长因子的浓度，并添加一种称为Matrigel的标准细胞培养成分。其结果与胚胎中的眼睛发育非常相似（见“如何培养眼睛”）。在培养的第六天，脑球开始长出气球状的视网膜细胞生长物，然后这些生长物自身塌陷，形成双层视杯。笹井的团队将它们剪下来——“就像从树上摘苹果一样，”笹井说——将它们转移到不同的培养环境中，让它们自由生长。两周后，这些视杯形成了视网膜的所有六层，这种结构与8天大的小鼠的眼睛相似（在这个年龄，小鼠仍然是盲的）。这些细胞能够在没有周围组织支持的情况下自行完成这一戏剧性的生物力学过程1让笹井和任何其他人一样感到震惊。“当我看到它时，我想，'我的天啊'。形状、拓扑结构和大小都被重现了，”他说。他小心翼翼地解释了接下来要说的双关语，他补充说：“在英语中，当你感到惊讶时，你会说 'eye-popping' ——所以我们真的认为这太令人震惊了。”
用人类细胞重现结果是显而易见的，但并非简单的下一步。伦敦大学学院的眼科医生和神经科学家彼得·科菲尝试按照笹井的配方用人类细胞培养视杯，正如科菲所说，“彻底失败了”。笹井今年报告10说他已经完成了这项壮举，他说这需要仔细调整，以适应人类胚胎干细胞的敏感性。例如，因为这些细胞的生长速度比小鼠的细胞慢三倍，所以笹井必须从9,000个细胞开始，而不是3,000个。科菲说他的经验让他意识到笹井的实验室积累了多少专业知识。“他们已经做了很长时间了。真棒，”他带着善意的嫉妒说。
万众瞩目
所有这些都不会创造出可以像灯泡插在灯座上一样插入眼眶的眼睛。即使笹井能够让他的视杯发育成成熟的视网膜，研究人员也几乎不知道如何将移植的视网膜连接到大脑上。
这项工作提供的潜在优势是能够获得大量纯净、高密度、组织良好的感光细胞，并且可以精确选择其发育阶段——这在标准的二维培养中难以实现。佐佐井最终希望，他的视杯能够提供感光细胞薄片，这些薄片可以被植入到因视网膜色素变性或黄斑变性等疾病而受损的视网膜中。佐佐井通过拿起一叠纸来代表视网膜层，然后将一张纸滑入其他纸张之间来演示该过程。
但是，正如研究眼部干细胞技术的其他研究人员所发现的那样，将移植的感光细胞与视网膜的其余部分以及大脑连接起来并非易事。加利福尼亚州圣莫尼卡的干细胞治疗公司Advanced Cell Technology的首席科学官罗伯特·兰扎对此持怀疑态度。“我不认为我们已经接近能够以任何有意义的方式连接这些细胞的时候，”他说。
阿里则更加乐观。今年四月，他的团队报告11称，他们通过移植从几天大的小鼠身上提取的感光细胞前体细胞，改善了部分失明小鼠的视力。阿里和佐佐井的另一位合作者、理研发育生物学中心的Masayo Takahashi，正在开始提取使用佐佐井的方法培养的感光细胞薄片，并将它们移植到小鼠体内；高桥计划在年底前将其移植到猴子体内。他们都对早期结果保持谨慎，但高桥表示，在小鼠体内，移植的感光细胞“存活良好”。
激素挑战
佐佐井将目光投向了更复杂的神经组织。去年11月，他报告3形成了垂体的一部分——他迄今为止“最复杂”的组织。在胚胎中，垂体是在两个不同的组织整合形成囊状结构时产生的。佐佐井通过体外再现了这一过程，部分原因是使用了比培养小鼠视网膜多三倍以上的胚胎干细胞；这种调整似乎增加了细胞交换的信号水平。当移植到垂体被敲除的小鼠体内时，这些初级器官恢复了内分泌系统并挽救了小鼠的生命。这项工作最终也可能提供纯净的、特化的细胞供应，可用于治疗内分泌疾病。
佐佐井希望通过培养更好的垂体（配备血液供应）、包含所有六层组织的脑皮层以及足够成熟到可以检测光线的感光细胞来改进他早期的工作。但他接下来的主要任务是培养小脑，这将涉及培养和整合三种不同胚胎来源的组织。这位“媒人”已经在努力营造合适的气氛。“当一个男孩遇到一个女孩时，他们会开始自己的故事——但不是在挤满人的大礼堂里，”他说。“你需要把他们放在海滩上或迪斯科舞厅里。我们的系统只是要创造这种环境。”
佐佐井计划在小脑之后研究什么是一个秘密，但他希望最终能够涵盖整个大脑。他的意思不是要建造一个大脑——那将是非常困难且在道德上充满争议的。相反，他想弄清楚大脑的各个部分，它们具有惊人的自主生长和组织能力，是如何结合并折叠成如此复杂结构的。
“我不想成为一个零件制造者，制造越来越多的组织，”佐佐井说。“我总是想要一些概念上不同的东西。”