邮购 CRISPR 工具包让任何人都能破解 DNA

“我们不会生病吧？”我的室友布雷特问我。当我跪下来把一盘大肠杆菌（这是我从网上买的 DIY CRISPR–Cas9 工具包的一部分）塞进冰箱，放在鸡蛋、草莓酱、啤酒瓶和一块奶酪旁边时，他畏缩了一下。

“不会的，标签上写着‘非致病性’，”我回答说，尽量让自己的语气听起来让人放心。但老实说，我根本不知道自己在做什么。我把所有的食物都推到冰箱壁边，并在活细胞培养皿周围留下了两英寸的边界——这是微生物和我们晚餐之间的无人区。几英寸可能无法阻止这些细菌，但我认为这样做没什么坏处。

CRISPR–Cas9（简称 CRISPR）为科学家们提供了一种强大的方法，可以精确地改变微生物、植物、小鼠、狗甚至人类细胞中的 DNA。该技术可能有助于研究人员培育抗旱作物、开发更好的药物、治愈遗传疾病、根除传染病等等。问任何一位生物学家，他们很可能会告诉你，CRISPR 是一项革命性的技术。它既便宜又有效，而且在许多情况下，它的效果比旧的基因改造方法好得多。生物学家还会告诉你，CRISPR 非常容易使用。但“容易使用”意味着什么呢？

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我不是 DIY 科学家，更不是专业科学家。你不会看到我周末在实验室里用棉签擦拭我的脸颊细胞来提取 DNA，或者摆弄酵母。但我很想知道：CRISPR 真的很容易，即使像我这样的业余爱好者也能对科学做出有意义的贡献吗？而且，这项新技术是否让基因编辑变得如此容易，以至于我们需要担心 DIY 科学家在他们的地下室里制造出流行病毒？如果你在 Google 上搜索“DIY CRISPR”，就会出现 类似“如果有人使用这个 DIY 基因黑客工具包制造出突变细菌会发生什么？”的故事。

我试图自己找到所有这些问题的答案，从我旧金山公寓厨房里的那盘细菌开始。

剪切和拼接

CRISPR 代表“成簇的规律间隔的短回文重复序列”。CRISPR 系统由两个部分组成：一种称为 Cas9 的蛋白质和一种引导 RNA，它是一串具有特定遗传密码的核酸分子。将它们放在一起，它们就形成了一种工具，可以用来调整生物体的基因组。要做到这一点，CRISPR 会在生物体的 DNA 中搜索特定的序列——特别是引导 RNA 编码的序列，该序列包含目标 DNA 的反向序列。“Cas9 会打开 DNA，它会在非常小的区域内分离双螺旋的链，并允许引导 RNA 与其中一条链配对，”犹他大学生物化学教授达纳·卡罗尔解释说。“如果匹配良好，就会发生切割。如果匹配不好，Cas9 和[引导]RNA 会脱落并尝试其他地方。当它找到正确的序列时，Cas9 蛋白会在那个精确的位置切割 DNA。”

此时，如果你让细胞自行处理，它通常会修复 CRISPR 的切割——但它偶尔也会在修复过程中犯错误，破坏基因或基因组的其他部分。由于 CRISPR 在细胞修复后会反复返回并再次切割 DNA，因此基因最终会被破坏，或者用专业术语来说，会被敲除。而且，如果你添加新的 DNA，细胞可能会在修复切割时将其合并。这意味着你可以在基因组中你想要的位置插入 DNA——你只需要知道你想要的目标区域的生物体遗传序列。

科学家最初在古细菌和细菌中发现了这个复杂的系统，它们利用 CRISPR 来切割入侵的病毒。但几年前，研究人员发现如何重新利用 CRISPR，使其在他们想要的几乎任何生物体中运行。现在，它使基因工程比以往任何时候都更容易。

对于我自己的实验，我需要的所有东西都在一个小纸板箱里——各种瓶子、试管、培养皿、粉末和液体（以及大肠杆菌）。我从众筹网站 Indiegogo 上以 130 美元的价格订购了我的工具包，这是一个由旧金山湾区生物黑客乔赛亚·扎伊纳发起的 活动的一部分。扎伊纳拥有分子生物物理学博士学位，并在 NASA 担任了两年研究员。他在自己的公寓里进行了众筹活动，到活动结束时，他筹集了 7 万多美元，售出了 250 个 DIY CRISPR 工具包——其中一个现在就放在我的餐桌上。扎伊纳现在已经售出了一千多个工具包，主要是在他公司的网站 The Odin 上销售。

工具包实验背后的想法很简单。目标：修改大肠杆菌，使其可以在通常会杀死细菌的抗生素链霉素上生长。通过工具包中的材料和说明，我将把 CRISPR 引入细菌细胞，并用它来改写它们 DNA 的一小部分，创造出在链霉素上快乐生长的基因改造细胞。最后，CRISPR 将追踪到并只改变大肠杆菌基因组中 460 万个碱基对中的一个碱基对（它们是 DNA 的构建模块）。它将用化学化合物胞嘧啶替换腺嘌呤——或者，用遗传字母表来说，将“A”替换为“C”。由于这个微小的代码变化，我的细菌细胞将产生氨基酸赖氨酸而不是另一种氨基酸苏氨酸。如果我的基因编辑成功，这将阻止链霉素干扰大肠杆菌。

五月份一个星期一下午，我戴上乳胶手套，在餐桌上铺上报纸。我从冰箱里拿出三个小塑料试管，从我的 DIY 工具包中拿起一个移液管——一种实验室中用来测量液体的便携式仪器——并开始将 CRISPR 成分添加到大肠杆菌试管中。

我把 Cas9 蛋白和引导 RNA（它们以液体的形式装在小的塑料试管中）放入我的细菌细胞中。然后我把移液管浸入一个装有 DNA 的小试管中，试图吸取 10 微升。结果什么也没吸出来。我眯着眼睛看着那小滴透明液体，才意识到它已经冻得结结实实了。我不知道为什么。糟糕，我希望这不是什么问题。这会影响我的实验吗？我完全不知道，所以我只是等待 DNA 溶液解冻，然后把它注入到细菌试管中。经过几个步骤后，我把我的 CRISPR 细菌涂在三个塑料培养皿上，然后把它们放在我的洗衣房里。说明书上说要等待 24-48 小时，然后检查是否有小的白色细菌点。如果我看到点，CRISPR 就完成了它的工作，即拼接出链霉素抗性基因。如果没看到……好吧，失败也是科学过程的一部分。

我进行实验没有问题——CRISPR 很容易，我总结道。我基本上只是测量、刮取和搅拌一些成分，偶尔给它们降温或加热。但是，尽管我想象中 CRISPR 给了我像神一样的力量，我实际上对我对细菌所做的事情几乎没有发言权。一切都是预先确定的，说明书就像菜谱中的步骤一样为我安排好了：“向新的离心管中加入 100 微升转化混合物”，“将该试管在冰箱中孵育 30 分钟”，等等。最终，我没有做出任何决定。当然，我可以设计一个定制的 CRISPR 实验——但这需要更多的时间、更多的材料、更多的钱，以及比我目前拥有的更多的知识。

48 小时后，我检查了我的细菌。我祈祷着，打开了第一个培养皿的盖子。没有白色点。然后是第二个培养皿：什么也没有。我的胃因失望而下沉。然后我轻轻地抬起第三个培养皿的盖子，看到了……一些东西。培养皿上有两个淡淡的乳白色圆圈。CRISPR 起作用了吗？也许吧。但为什么只有一个培养皿有白点，而其他培养皿没有呢？我给每个培养皿都做了相同的步骤。也许是我的大脑在跟我开玩笑。或者也许我污染了第三个培养皿。如果我能把我的培养皿给知道如何解读它们的人看就好了。像科学家一样。不幸的是，在我的厨房里没有可以问的人。

向所有人开放

几周后，我开车到旧金山以南 40 英里处，去见一位名叫约翰·索萨的 DIY 科学家，他对 CRISPR 的了解比我多得多。我们在森尼维尔的 BioCurious 社区实验室见面，他大部分周末和一些晚上在那里工作。BioCurious 位于圣克拉拉，是一个配备科学设备的共享工作空间，由“科学家、技术人员、企业家和业余爱好者共享，他们认为生物学创新应该让所有人都能获得、负担得起和开放”，根据其网站介绍。该实验室由捐款和会员资助——索萨是其几十名会员之一。

身高六英尺五英寸的索萨比大多数人都要高。“我可能是最高的 DIY 生物学家，”他开玩笑说。他很容易笑，这抵消了他的身高，使他显得温和、随和。他今年 40 岁，深色的头发上夹杂着银丝。索萨来自斯里兰卡，15 岁时来到美国上大学学习计算机科学，他曾在美国银行和 IBM 担任计算机安全专家和软件工程师。他现在有一份计算机安全方面的工作——但他把大部分空闲时间都花在 BioCurious。“你可以说我没有生活，”他笑着说，“这是我最大的爱好。”他从 BioCurious 的其他人那里、通过阅读科学论文、观看 YouTube 视频、参加讲座，以及通过自己的研究中的反复试验，学到了一切他所知道的科学知识（理论和实验技术）。

索萨是 BioCurious 中为数不多的使用 CRISPR 的 DIY 科学家之一。他第一次是在 2012 年从生物化学家詹妮弗·道德纳发表在《科学》杂志上的论文中读到这项技术的。加州大学伯克利分校的教授道德纳是 CRISPR 的先驱之一。“我并不认为这是一件大事，因为我知道已经有其他方法可以修改 DNA，”他回忆说，“但我确实认为，‘这是我可以做的事情。’”他从 2013 年开始尝试使用 CRISPR。

在一个闷热、阴天的下午，我跟随索萨走进了生物好奇实验室（BioCurious）。我们穿过大厅，进入一个没有窗户的大房间。房间里有塞满液体的巨大柜子、成排的乳胶手套、一个巨大的生物安全柜、微波炉和冰箱。显微镜、天平、离心机和许多其他磨损严重的科学设备散落在实验台上。房间里充满了机器嗡嗡作响的平静声音，试管在附近的培养箱中安静地摇晃着。约翰在房间里走来走去，寻找温度计。“DIY 实验室的一件事是，你把东西放在某个地方，它总是会出现在别的地方，”他告诉我。

我加入了索萨在 BioCurious 的实验，以便更多地了解 CRISPR 对 DIY 科学家意味着什么，并且在他的帮助下进行一个（希望）更成功的实验。我们决定了一个非常基本的目标：我们将使用强大的编辑工具来切割他已经从酵母细胞中提取的 DNA。这个任务比我在厨房里尝试的要容易，因为你不需要让 CRISPR 进入细胞内部就能切割 DNA。专业科学家可能会将这种方法用作中间步骤，例如当他们需要将 DNA 切割和粘贴在一起以制造基因作为更大研究项目的一部分时。“这是每个人每天都会做的一种实验，”杜克大学生物医学工程教授查尔斯·格斯巴赫解释说，但他指出，传统上，研究人员使用一种叫做限制性酶的蛋白质，而不是 CRISPR 来做这件事。

索萨和我戴上乳胶手套，小心地将液体吸入试管中，从头开始制作我们的引导 RNA——我们首先合成了具有特定序列的 DNA 链，将其用作 RNA 的模板，然后破坏 DNA 并从我们的试管混合物中分离出引导 RNA。之后，我们将 RNA 与使 CRISPR 在此实验中发挥作用所需的其他材料一起放入一个新的试管中：蛋白质缓冲液、牛血清白蛋白（从牛身上分离出的蛋白质）、水。索萨用他的移液器吸起酵母 DNA。毫无预警，塑料针头尖端掉进了 DNA 试管中。他告诉我，有人将这些针头捐赠给他们的实验室，但它们的尺寸不正确。“我想你体验到了完整的 DIY 体验，”他笑着说，并将塑料尖端推回移液器上。然后他拿起 Cas9 蛋白。“这是世界著名的 Cas9，”他说，并把它递给我。我将它添加到我们的试管中。

在 CRISPR 出现之前，DIY 科学家没有简单、廉价或可靠的方法来精确编辑 DNA。他们中的许多人无法负担当时专业科学家用于基因编辑的昂贵且不完美的工具。“在 CRISPR 之前，有 TALENS [转录激活因子样效应核酸酶] 和锌指核酸酶——较旧的技术，不如现在精确或可靠，”索萨解释说。“它们超出了 DIY 科学家的预算和时间限制。”索萨说，如果 DIY 者使用其他技术，他或她可能需要花费数千美元进行基因工程实验。但是有了 CRISPR，它就便宜得多，特别是如果你想多次尝试实验。“使用 TALENS，你尝试一次就会失败，”索萨说。“使用 CRISPR，你可以尝试多次。仅这一点就意义重大。”

这意味着 CRISPR 为 DIY 者提供了一种全新的进行科学研究的方式。到目前为止，索萨和他的实验室伙伴已经尝试了多种使用 CRISPR 的方法：切割酵母基因组、切割大肠杆菌细胞内的 DNA，并尝试通过缩小 CRISPR 系统或将其他分子附着到它上来修改 CRISPR 系统。索萨对他的 CRISPR 研究有目标。“我想了解细胞的真正运作方式，以及其中发生的所有小事情，”他解释说。“当出现问题时[例如在疾病中]，如何修复它或使其按照我想要的方式工作。”

几个小时后，索萨和我检查了 CRISPR 是否切割了我们的酵母 DNA。我们将 DNA-CRISPR 混合物染成蓝色，并将其通过带电凝胶，凝胶将较大的 DNA 片段与较小的片段分开。凝胶中的微小通道从带电的一端运行到另一端，切片的 DNA 链被拉过这些通道朝向带正电的一侧。如果我们的实验成功，我们应该看到两个蓝色条带，代表短的 CRISPR 切割的 DNA 链，在一个位置，以及一个蓝色条带，代表较长的未切割 DNA 片段（我们的对照）在另一个位置。

索萨将凝胶带到浴室里，我们在那里关掉灯，并在蓝光下观察它。我屏住呼吸，同时检查凝胶上的标记。一道浅蓝色条带在黑暗中闪耀——对照——另一道单条带照亮了我们应该看到 CRISPR 处理的 DNA 的位置。“我不知道发生了什么，但它看起来不对，”索萨说，“我认为它没有成功。”

我离开实验室时感到沮丧，然后回到旧金山。索萨几分钟后发短信给我。

嘿，我弄清楚发生了什么。根本没有 DNA 可供开始，他写道。

怎么回事？ 我回复道。

我想 DNA 要么降解了，要么被稀释得太厉害了，他写道。

即使我们让所有其他部分（RNA、蛋白质等）都正常工作，也没有关系。我们没有给 CRISPR 任何 DNA 来切割。我对 CRISPR 的第二次尝试彻底失败了。

更好、更快、更便宜

撇开我自己令人沮丧的 CRISPR 斗争不谈，我想看看专业生物学家如何使用 CRISPR，所以我参观了加州大学伯克利分校的尼帕姆·帕特尔实验室。在快速参观了实验室之后，我坐下来，盯着显微镜里的一只小型、扭动的海洋生物：Parhyale hawaiensis，俗称海滩跳蚤。Parhyale 长一厘米，看起来很渺小——你会在海滩上踩到它而不会注意到。但在显微镜下，这只雌性跳蚤像一只巨大的半透明虾，有许多强壮、踢动的腿。Parhyale 是这个实验室的明星。“我们正在研究你如何发育出一个单独的身体，”帕特尔实验室的博士生艾琳·贾维斯解释说，“以及你如何在进化过程中构建身体形态。”他们正在使用 CRISPR 来做到这一点。

借助 CRISPR，这些研究人员敲除了Parhyale 中所谓的Hox 基因。Hox 基因存在于包括人类在内的所有动物中，它们控制着动物身体结构的形成。其中，它们决定了身体的哪个部分长出哪些附属物——例如游泳腿、爪子和触角。用 CRISPR 敲除某个Hox 基因，Parhyale 会在应该长跳跃腿的地方长出向前行走的腿，例如。

Parhyale 有九个Hox 基因，帕特尔的团队已经敲除了其中的七个。研究人员还计划使用 CRISPR 将全新的基因添加到Parhyale 中——他们已经做过一次，通过插入一个编码绿色荧光蛋白的基因，这使得研究人员能够可视化Parhyale 中特定Hox 基因的表达位置。“从进化的角度来看，这[使我们]能够了解物种之间身体结构的进化方式，”帕特尔解释说，在将Parhyale 与研究充分的果蝇Drosophila 进行比较时。“我们认为这种进化模式有助于我们了解进化创造动物多样性的总体机制…… 我们所学到的知识提高了我们对这些基因在其他动物（包括人类）中的功能的认识。”

CRISPR 改变了帕特尔和他的同事进行研究的方式。他的实验室研究Parhyale 大约 20 年了。在 CRISPR 出现之前，他们使用另一种技术来敲除基因，这种技术需要更多的资金，而且即使如此，效率也不是很高。他们用其他方法在一组Parhyale 胚胎中敲除单个基因的成本约为 900 美元。这种被称为“RNA 干扰”的技术可以沉默基因的表达——它不像 CRISPR 那样在基因上敲除它。问题是，有时这种方法根本不起作用。

现在，他们敲除一个基因的成本不到 100 美元。“突然之间，有了 CRISPR，你就不必决定‘我应该将所有资源投入到哪个基因？’”贾维斯说，“你可以尝试许多不同的基因。”而且有了 CRISPR，他们能够破坏多达 75% 的Parhyale 胚胎中的基因，而旧技术的成功率最高为 25%。更棒的是，他们现在能够使用 CRISPR 一次突变多个基因，这意味着他们现在可以看到基因是如何相互作用的。当研究人员尝试用旧技术突变多个基因时，很少成功。（尽管帕特尔指出，旧的 RNA 技术对于某些应用仍然非常有用）。

他们的研究使用 CRISPR 所需的时间也更少——在帕特尔实验室 2015 年在Current Biology 上发表的一项研究中，他们在大约一年内敲除了六个Hox 基因。在此之前，他们已经花费数年时间尝试使用旧方法破坏特定的Hox 基因，但从未成功。“一切都变得更快了，”遗传学、基因组学和发育学教授帕特尔说。“CRISPR-Cas9 是一个非常优雅的系统，而且非常容易控制。”它还使研究更奇特的生物（除了标准的果蝇和小鼠之外）变得更加简单，例如Parhyale 或蝴蝶等动物。“一直以来，使用新的生物体进行研究都很困难，”贾维斯说，“CRISPR 很棒，因为它突然之间，你不必花费数十年的时间来开发一个模型。”只要你有你想靶向的基因的序列，你就准备好了。

帕特尔的实验室绝不是唯一一个利用 CRISPR 的实验室——世界各地的科学家正在探索基因编辑工具的各种不同用途，例如消灭传播疟疾的蚊子，寻找治疗癌症的新方法，或改造抗病作物。7 月，研究人员宣布他们已成功编辑了有生命的人类胚胎的基因组，使用 CRISPR；该技术使他们能够修复胚胎 DNA 中引起疾病的突变（尽管有些人现在对研究人员的结果表示怀疑）。仅仅几周后，马萨诸塞州的科学家报告说，他们在实现猪到人器官移植方面取得了重大进展。他们使用 CRISPR 使猪基因组中固有的 25 种病毒失活，从而克服了使猪器官移植对人类安全的一个重大障碍。

扮演上帝

我的 CRISPR 实验已经结束了——我学到了什么？首先，我发现我的室友担心冰箱里的 DIY CRISPR 工具包会让我们生病，这并非完全是异想天开。今年，德国当局限制进口 Odin DIY CRISPR 细菌工具包，此前巴伐利亚健康和食品安全局对两个工具包进行了测试，发现它们含有潜在的致病细菌。但即使是欧洲疾病预防控制中心也得出结论，认为没有什么好担心的——“对于用户来说，工具包中污染菌株的感染风险很低……假设他们是健康的人。”（Zayner 拒绝就此事发表评论，但他公开在 Twitter 上回应，批评了巴伐利亚机构使用的方法，并否认他的公司有任何不当行为。这些工具包仍然可以通过 The Odin 在网上购买。）

至于我更大的问题——未经培训的 DIY 爱好者是否真的能取得科学突破？我询问了学术研究人员的看法。Dana Carroll 认为，业余爱好者可以做出有意义的发现。“在专业的科学界，人们不断提出使用这项技术的新方法——人们真正受限于他们的想象力，”他解释道。“有可能在他们的车库或厨房里工作的人会提出一种新颖的应用或解决专业人士尚未解决的问题。” Carroll 说，DIY 爱好者可以通过参加讲座或直接通过他们的网站联系研究人员，来分享他们的任何发现。然而，他指出，DIY 社区面临着局限性，因为业余科学家可能缺乏必要的资源。“他们不太可能将一项重大应用完全实现，”他说，“但他们肯定可以开始做一些事情。”

最后，关于噩梦般的场景：CRISPR 是否太容易使用，以至于我们需要担心生物黑客——无论是意外还是故意地——制造危险的病原体？Carroll 和其他人都认为，将 CRISPR 掌握在普通人手中的危险相对较低。“人们设想了一些场景，科学家可以使用 CRISPR 来产生毒性病原体，”他说。“风险有多大？它不是零，但相当小。” Gersbach 也同意。“现在，很难想象它会以一种真实的方式变得危险，”他解释说，“如果你想造成伤害，有比使用这种高度复杂的基因编辑技术更简单的方法。”

回到 Patel 的实验室，Jarvis 将我显微镜下蠕动的雌性沙滩跳蚤换成了一个微小的Parhyale胚胎。Jarvis 告诉我，她敲除了一个名为 Abd-B 的 Hox 基因——这个胚胎会长出应该长游泳腿的地方长出跳跃腿，长出前行腿而不是锚腿。此时，在我看来，它只是一个不透明的糊状球。

在我旁边，另一位研究生正在检查一片棕色和金色的蝴蝶翅膀的碎片——Patel 的实验室也在用 CRISPR 敲除蝴蝶基因，以观察它们如何形成翅膀颜色。“一位老研究生曾经开玩笑说，我们正在对翅膀进行基因改造，以制作《蒙娜丽莎》，”Jarvis 告诉我。我笑了笑，又看了一眼显微镜。我的一口气突然吹到了 Parhyale 胚胎上。它在培养皿中疯狂地跳舞，像一粒被风暴卷起的沙粒。