安妮塔碗里的食物不是普通的狗粮。虽然这个盘子里有颗粒和湿粮，但还撒上了一层绿色的粉末——这是一项开创性实验的产物，旨在解决血友病治疗中可能致命的并发症。安妮塔之所以得名，是因为她的红色皮毛让饲养员想起了动画电影《101斑点狗》中的角色，她是一只患有B型血友病的基格犬（比格犬和凯恩梗犬的杂交品种）。
和患有这种罕见遗传病的人一样，安妮塔天生缺乏凝血因子IX，这是一种帮助血液凝结的蛋白质。当用替代凝血蛋白治疗时，这只狗自然会产生针对疗法的抗体或抑制剂——这个问题在约5%的B型血友病患者中也可见。在这些人中，免疫系统将治疗性蛋白质识别为危险物质，导致身体停止接受这种蛋白质作为血液的正常组成部分，并在其阻止出血之前将其破坏。继续接受因子替代疗法可能导致危及生命的过敏反应，如过敏性休克。
对于A型血友病来说，问题甚至更严重，A型血友病比B型血友病常见四倍，并且凝血链中缺失的环节是一种叫做凝血因子VIII的蛋白质。约30%的A型血友病患者会对替代凝血因子VIII产生抗体。
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有疗法可以消除这些抗体。例如，有些人接受一种名为免疫耐受诱导疗法的强化治疗，该疗法包括定期静脉注射凝血因子。但这既耗时又昂贵（对于一个五岁的普通患者来说，大约需要100万美元），而且该疗法仅对约四分之三的患者有效。“治疗患有抑制剂的血友病的挑战令人震惊，”北卡罗来纳大学教堂山分校弗朗西斯·欧文血液研究实验室主任蒂莫西·尼科尔斯说，该实验室维护着安妮塔所属的血友病犬群。
诱导已产生抑制剂的人的免疫耐受是一种方法。但完全避免这个问题会更好。“如果你能首先预防抗体的形成，通过找到某种产生免疫耐受的方法来绕过这种方案，那将是一个主要的优势，”安大略省金斯顿市女王大学的临床医生和出血性疾病专家大卫·利利克拉普说。
安妮塔盘子里的绿色粉末可能正是这样做的。这种口服治疗是一种浓缩的冷冻干燥莴苣叶细胞，每个细胞包含约10,000个叶绿体——负责光合作用的细胞器——这些叶绿体经过基因工程改造，可以产生凝血因子IX。这些蛋白质本身不能用于预防出血事件，因为植物细胞中的细胞机制无法将人类凝血因子包装成生物活性形式。然而，它们可以做的是防止免疫系统对后续治疗发起攻击。
生物工程莴苣背后的研究人员已经表明，通过给小鼠喂食基于这些植物的产品，可以预防抑制剂的形成和严重的过敏反应。如果该策略在安妮塔和她的犬舍伙伴身上——最终在人类身上——也有效，那么它可能构成首个保护血友病治疗相关免疫反应的产品的基础。
安妮塔是仅有的两只接受生物工程莴苣的狗之一。“到目前为止，一切进展顺利，”宾夕法尼亚大学牙科医学院转化研究主任、首席研究员亨利·丹尼尔说，他来自费城。
耐受行为
2006年，利利克拉普证明，简单的口服治疗可以训练免疫系统不产生抑制剂。他和他的同事使用A型血友病小鼠模型，通过鼻子或嘴巴给小鼠喂食纯化的人凝血因子VIII蛋白片段。研究人员发现，在凝血因子VIII替代疗法后，该治疗在一定程度上提供了针对抗体产生的保护。但这种方法没有将足够量的因子输送到肠道或鼻腔中的免疫细胞，以完全抑制抑制剂的形成。
丹尼尔提出了一种改进的递送系统。他首先关注B型血友病。丹尼尔及其团队采用他之前开发的一种延迟1型糖尿病发作的技术，对烟草植物进行基因改造，使其叶绿体中表达人凝血因子IX。（丹尼尔后来改用莴苣。）
叶绿体DNA与植物细胞核中的基因组DNA分离，细胞中大量的这些微小细胞器使得大量的凝血蛋白在每片烟叶中积累。一旦摄入，植物细胞壁会保护凝血蛋白免受胃酸的破坏。消化道下游的肠道微生物随后会咀嚼细胞壁，释放凝血因子蛋白。
为了将蛋白质靶向免疫系统，丹尼尔随后附着了第二种蛋白质，该蛋白质对人类肠道内侧发现的受体具有高结合亲和力。通过将这种融合构建体束缚在肠壁上，凝血蛋白可以被吸收到体内，并由免疫系统中诱导耐受性的特殊细胞处理。
丹尼尔随后与盖恩斯维尔佛罗里达大学的分子生物学家罗兰·赫尔佐格合作，在动物模型中测试了这种基于植物的产品。2010年，他们表明，以这种方式口服递送在叶绿体中表达的凝血因子IX导致小鼠体内几乎检测不到抑制剂水平，也没有过敏性休克的迹象。“这些小鼠是健康的，它们没有表现出过敏反应，也没有形成抑制剂，”赫尔佐格说。“这非常令人兴奋。”
然后，丹尼尔修改了烟叶，使其表达凝血因子VIII，并将叶子粉末运送给赫尔佐格。今年早些时候，这两位研究人员及其团队记录了在A型血友病小鼠模型中抑制剂形成的抑制，甚至逆转了预先存在的抑制剂。
抑制剂控制
正在研究的其他预防凝血因子疗法抑制剂形成的策略包括免疫抑制剂和消耗特定免疫细胞的药物。然而，这些疗法具有许多副作用，包括增加感染的易感性。
一种可能更安全的选择来自马萨诸塞州沃特敦的Selecta Biosciences公司。Selecta开发了一种纳米颗粒递送系统，其中一种免疫调节化合物包含在直径仅为150纳米的可生物降解塑料颗粒中。当与凝血因子VIII一起注射到A型血友病小鼠模型中时，纳米颗粒将其有效载荷递送到淋巴组织中负责启动免疫反应的细胞。这些细胞反过来指示凝血因子VIII特异性免疫细胞对凝血蛋白产生耐受性，从而抑制对替代疗法的错误导向的抗体反应——所有这些都不会影响免疫系统的其余部分。
图片来源：Kwang-Chul Kwon、Jin Su和Henry
丹尼尔，宾夕法尼亚大学
马里兰州贝塞斯达市美国军事健康科学大学的大卫·斯科特和他的同事与Selecta合作，证明在用纳米颗粒制剂治疗后，抑制剂在至少六个月内保持无法检测到。“这强调了我们实际上是在教导免疫系统对凝血因子VIII产生耐受性，”Selecta的首席科学官高志敬说。
正在测试用于抑制剂控制的纳米技术方法也可能改进目前处于临床研究前沿的血友病治疗：基因疗法。使用标准的基因疗法方法，研究人员已经表明，他们可以在B型血友病成人体内实现凝血因子IX的长期表达，且水平足够高，可以将这种出血性疾病转化为轻度疾病（参见S6页）。到目前为止，在针对这种病毒疗法的临床试验的少数人类参与者中，还没有报告抑制剂形成的证据。
尽管如此，标准的肝脏靶向基因疗法仍然存在一系列潜在的并发症，包括有害突变的风险以及身体对用于携带导致血友病的缺陷基因的正确形式的病毒载体产生免疫反应的风险。这就是为什么几个研究小组试图用纳米颗粒代替病毒载体，纳米颗粒可以将基因疗法作为“DNA药丸”递送。
药丸保护
DNA药丸将DNA质粒——含有编码凝血因子VIII或凝血因子IX的基因的细菌环状DNA片段——与由壳聚糖制成的纳米颗粒结合起来，壳聚糖是一种坚韧的聚合物碳水化合物，存在于甲壳类动物的外骨骼中。壳聚糖保护治疗性基因产物并将其护送到肠道。“口服途径具有显著的吸引力，”加拿大汉密尔顿麦克马斯特大学的基因疗法研究员冈萨洛·奥特拉诺说。“关键是实现一种持久、有效且完全安全的递送系统。”
奥特拉诺小组以及德国和美国的其他研究团队的独立研究表明，这种口服基因疗法不会激活免疫系统。事实上，基于纳米颗粒的基因疗法产生的蛋白质暴露于肠道粘膜可以预防抑制剂的产生，并恢复A型和B型血友病小鼠模型中的凝血因子活性。“这种方法确实可能为患者带来巨大的益处，”输血医学专家约尔格·舒特鲁普夫说，他领导了在法兰克福德国红十字会献血服务中心进行的一项研究。
纽约市哥伦比亚大学的生物医学工程师金·梁，他的团队是第一个在小鼠身上证明这种方法成功的团队，甚至尝试给患有A型血友病的狗喂食壳聚糖-DNA纳米颗粒。梁发现了一些基因转移的证据，以及动物体内抑制剂的减少。但出血时间没有缩短，如果产生足够水平的凝血因子VIII，则应该会缩短。“这仍然是一个非常低效的过程，”梁说，“因此需要持续优化。”
虽然理想情况仍然是既能纠正疾病又能提供免疫耐受的基因疗法，但一些科学家已将重点放在治疗抑制剂形成上，而不必担心修复疾病。在这种策略下，人们仍然需要接受因子替代疗法，但他们可以这样做，而无需担心抑制剂的产生。
考虑到这一点，由斯科特和赫尔佐格领导的独立团队采用了传统的病毒载体方法，通过基因疗法诱导耐受性。但研究人员没有像大多数基因疗法那样将凝血因子蛋白的整个基因递送到细胞，而是使用病毒对免疫调节B细胞进行基因改造，使其表达与称为免疫球蛋白的免疫分子融合的凝血因子片段。这导致了A型和B型血友病小鼠模型的长期耐受性。
赫尔佐格说，追求这种基因疗法方法提供了一定程度的对冲。“每种策略都有潜在的优势和劣势，”他指出，“我们还不真正知道哪种策略会有效，或者哪种策略可能在人体中最有效。”由于如此多的治疗策略正在通过临床前管道推进，科学家和临床医生仍然希望至少有一种策略最终会成功，从而彻底消除血友病患者抑制剂形成的问题。
本文经许可转载，最初于2014年11月26日首次发表