加利福尼亚大学旧金山分校的微生物学家 Joe Bondy-Denomy 回忆说，这一切最初都像“有点愚蠢的事情”。在 2010 年代初的研究生期间，他试图用病毒感染细菌，而从理论上讲，这些病毒不应该有机会存活。他知道这些病毒，或噬菌体，很容易受到 CRISPR-Cas 细菌防御系统的攻击，科学家们已经利用该系统作为强大的基因编辑工具。在大多数情况下，他是对的：CRISPR 机制将入侵的噬菌体切成碎片。但在少数情况下，出乎意料的是，入侵者幸存了下来。
Bondy-Denomy 认为他搞砸了。“然后灵光一闪，”他说。也许细菌基因组内的某些东西正在解除其防御。也许这种自我破坏的 DNA 片段来自以前的病毒入侵者。
DNA 序列的快速比较证明了 Bondy-Denomy 的直觉是正确的。嵌套在细菌基因组内的噬菌体基因完全关闭了 CRISPR-Cas 系统，使细菌变得脆弱1。
支持科学新闻报道
如果您喜欢这篇文章，请考虑通过以下方式支持我们屡获殊荣的新闻报道 订阅。通过购买订阅，您正在帮助确保未来能够继续刊登关于塑造当今世界的发现和想法的有影响力的故事。
“Joe 得到了改变一切的结果，”多伦多大学的噬菌体生物学家 Alan Davidson 说，他当时是 Bondy-Denomy 的博士生导师。“他发现了一些我们从未期望过的惊人事物。”
Bondy-Denomy 与 Davidson、微生物学家 Karen Maxwell 和研究生 April Pawluk 一起，偶然发现了一种现在被称为反 CRISPR 的工具。这些蛋白质就像 CRISPR 分子剪刀的石头。很快，它们就无处不在：现在已经表征了 50 多种反 CRISPR 蛋白，每种蛋白都有其自身阻断 CRISPR 系统剪切和粘贴作用的方法。
庞大的名单引发了许多关于细菌与其捕食者噬菌体之间古老军备竞赛的问题。但它也为科学家提供了一个工具包，用于控制基因编辑。
来源：《自然》
有些人正在使用这些蛋白质作为开关，以更精细地控制 CRISPR 系统在生物技术或医学基因编辑应用中的活性。其他人正在测试它们或其他 CRISPR 阻断分子是否可以作为最后手段的生物安全对策，能够控制某些基因组编辑的生物武器或失控的基因驱动。
“对于您能想到的任何关闭 CRISPR 系统的理由，反 CRISPR 蛋白都能发挥作用，”华盛顿州西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心的微生物基因组学家 Kevin Forsberg 说。
然而，尽管实验室中提出了越来越多的应用和概念验证实验，但研究人员尚未确定这些反 CRISPR 系统的治疗潜力。加利福尼亚大学伯克利分校的生物化学家、CRISPR 基因编辑的先驱之一 Jennifer Doudna 提出了一个她说每个人都在关注的问题：“您实际上如何以提供有意义的控制的方式使用这些系统？”
“这当然是整个反 CRISPR 领域需要发展的方向，”她说。“只是还没有发展到那里。”
一切混乱爆发
尽管人们越来越关注反 CRISPR 蛋白——2019 年每周大约发表一篇关于该主题的论文——但 Davidson 和他的学生最初的发现却鲜为人知。
对于大多数科学家来说，这似乎是进化战争的一个深奥的例子——特别是考虑到发现的反 CRISPR 蛋白都只针对一种特定形式的细菌防御，即 I 型 CRISPR 系统。基因组编辑的宠儿一直是 II 型系统及其典型的 DNA 切割蛋白 Cas9。
“为了让更广泛的生物学界真正注意到，”现在是 Cell 编辑的 Pawluk 说，“它必须是 Cas9”。
2016 年 12 月，仍在 Davidson 实验室工作的 Pawluk 和领导自己独立研究小组的 Bondy-Denomy 各自鉴定出 Cas9 酶的抑制剂 2,3。这一次，世界各地的研究人员都抓住了这些发现。“就像 CRISPR 世界中的其他一切一样，楔子的薄边开始进入，然后您就知道一切混乱都爆发了，”马萨诸塞大学医学院的分子生物学家 Erik Sontheimer 说，他是 Pawluk 论文 2 的合著者。
不到三个月，中国哈尔滨工业大学的结构生物学家就破译了 Bondy-Denomy 的反 CRISPR 蛋白之一 AcrIIA4 关闭 Cas9 活性的分子机制 4（参见“CRISPR 校正”）。几个月后，Doudna 与 Bondy-Denomy 和生物化学家 Jacob Corn（现任职于苏黎世瑞士联邦理工学院）合作，首次证明了反 CRISPR 蛋白具有实际价值：他们表明，将 AcrIIA4 与 Cas9 一起或紧随其后递送到人体细胞中，可以阻止基因编辑活动 5。
这很有用，因为如果 Cas9 保持活性时间过长，就会增加意外编辑的风险。Doudna 和她的合作者报告说，反 CRISPR 蛋白可以限制“脱靶”效应，自从 CRISPR 早期发展以来，研究人员和投资者一直对此感到担忧。
总部位于伯克利的 Acrigen Biosciences 首席执行官兼与 Bondy-Denomy 的联合创始人 David Rabuka 说，抑制脱靶活性将对 CRISPR 治疗领域做出重大贡献。该公司的宣传语是：“我们将使基因编辑更高效、更安全，”Rabuka 说。
反 CRISPR 蛋白还可以帮助将编辑活动限制在体内的特定细胞和组织中。2019 年，德国、日本和美国的研究团队各自独立地尝试将这些蛋白质与称为 microRNA 的小调控分子串联使用，以实现组织特异性编辑 6-8。由 Sontheimer 领导的美国团队甚至表明，该方法可以在小鼠身上起作用——他们是迄今为止唯一发表的研究，证明反 CRISPR 蛋白可以在活体动物中起作用，而不仅仅是细胞 8。
Sontheimer 和他的同事希望允许在肝脏中进行编辑，同时抑制其在小鼠所有其他组织中的编辑。因此，他们设计了一种反 CRISPR 蛋白，该蛋白在除 microRNA-122 存在的情况下外都具有活性，microRNA-122 仅在肝脏中发现。在小鼠中，反 CRISPR 成功阻止了 Cas9 在全身的编辑，除了肝脏这个器官。
尽管该论文侧重于肝脏定向编辑，但该平台是“即插即用”的，Sontheimer 说：任何产生高表达水平的独特 microRNA 的器官都可以通过这种方式靶向，前提是反 CRISPR 蛋白不会引发不良的免疫反应。
并非没有挑战的免疫
由于以前接触过携带 CRISPR-Cas 系统的微生物，许多人的免疫系统已经准备好攻击和禁用 Cas9 蛋白。这可能会构成挑战。在小鼠中，仅一剂基于 CRISPR 的药物就可能引发足够强的免疫反应，从而使后续治疗无效。
Sontheimer 认为，反 CRISPR 蛋白可能容易出现相同的排斥问题，可能会危及该技术并引发患者危险的炎症反应。
其他类型的 CRISPR 抑制剂不应有相同的限制。去年 5 月，由马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院和哈佛大学博德研究所的化学生物学家 Amit Choudhary 领导的一个团队描述了一种识别能够破坏 Cas9 活性的小分子药物的新方法 9。他的团队鉴定的化合物不如天然反 CRISPR 蛋白有效，但它们更可能偷偷绕过免疫系统，穿过细胞屏障，并允许对 Cas9 活性进行可逆控制。
在其他地方，研究人员设计了短链核酸，这些核酸抓住 Cas9 复合物的两个部分，并完全关闭人体细胞中的基因编辑 10。“我们非常肯定我们拥有的东西比目前所有最好的反 CRISPR 蛋白都更好，”南伊利诺伊大学卡本代尔分校的 RNA 生物化学家 Keith Gagnon 说，他领导了这项研究。包括加利福尼亚州利弗莫尔市桑迪亚国家实验室的病毒学家 Brooke Harmon 领导的其他小组也合成了微小的蛋白质片段，这些片段显示出作为反 CRISPR 剂的潜力。“有很多不同的选择很好，”Harmon 说。
这种多样性在医学应用中可能很重要：例如，限制基因靶向药物的编辑活性，或设计能够消灭难以治疗的细菌的噬菌体疗法，而不会受到病原体自身 CRISPR 防御的阻碍。它也可能有助于 CRISPR 阻断技术的其他拟议应用。
以基因驱动系统为例，科学家们在其中部署 CRISPR 基因编辑，以将 DNA 修饰迅速传播到整个人群中。一些公共卫生官员希望该技术可能完全根除携带疾病的蚊子或蜱虫，例如。
但对不可预见的生态影响的担忧比比皆是。许多政府官员和研究人员也担心基因驱动被武器化以消灭农业系统或传播致命疾病。
桑迪亚生物化学家 Joe Schoeniger 说，反 CRISPR 蛋白可以为这些潜在的生物攻击提供分子安全网。“您需要有一个关闭按钮，”他说。
目前，此类应用大多是假设性的。唯一发表的研究报告是研究人员使用反 CRISPR 蛋白来抑制酵母中的基因驱动 11。然而，这个想法正在获得关注，包括希望通过迫使有害基因在整个蚊子种群中传播来阻止疟疾传播的研究人员。
伦敦帝国理工学院的分子寄生虫学家 Andrea Crisanti 说，他已经使用反 CRISPR 基因来阻止蚊子根除基因驱动系统。这种基因驱动会破坏雌性生育能力，可以在大约十代内消灭实验室中的蚊子 12。但在未发表的工作中，他的团队在混合物中添加了反驱动蚊子，“它们可以完全 100% 阻止驱动，”Crisanti 说。“我们可以阻止人口崩溃。”
保险单
当 Crisanti 展望他的绝育策略的实地测试时，他想象着准备好装有反驱动蚊子的笼子，以防万一出现问题。“这有点像购买保险，”他说。
但对 CRISPR 控制的需求不仅仅限于基因驱动。“如果在临床试验中发生不良事件或基因组编辑器的不正当使用，我们只有在发生时才会知道那是什么样子，”美国政府国防高级研究计划局 (DARPA) 位于弗吉尼亚州阿灵顿的生物安全科学家 Renee Wegrzyn 说。
这就是为什么 DARPA 在 2017 年启动了“安全基因”计划，这是一项为期四年、耗资 6500 万美元的计划，旨在应对 CRISPR 技术的危险。这包括发现针对所有类型 CRISPR-Cas 系统的新抑制剂，并找到以独特和有用的方式发挥作用的反 CRISPR 蛋白。Bondy-Denomy、Choudhary、Crisanti、Doudna 和 Sandia 团队等都是这项基金的获得者。
除了其生物技术应用外，反 CRISPR 策略也为基础研究开辟了新的可能性。“它已成为我们最喜欢的工具之一，”纽约市哥伦比亚大学医学中心的神经表观遗传学家 Shawn Liu 说。Liu 研究了一种改良的 CRISPR-Cas9 系统如何通过表观遗传修饰（即不改变基础序列）改变基因的表达水平。反 CRISPR 蛋白帮助他展示了效果持续了多久 13。
当研究人员寻找能够比标准菌株更有效地抵御噬菌体攻击的细菌突变株时，它们也派上了用场。由加拿大魁北克市拉瓦尔大学的噬菌体生物学家 Sylvain Moineau 领导的一个团队专注于嗜热链球菌，这是一种用于制作奶酪和酸奶的微生物 14：“我们使用含有反 CRISPR 蛋白的噬菌体作为工具来寻找其他防御机制，”他解释说。
其他科学家正在将反 CRISPR 蛋白纳入生物传感器等工具中，这些工具可以跟踪治疗性基因编辑器在细胞内有多少活性，以及允许研究人员通过轻 flick 激光束打开 Cas9 基因组靶向的光遗传学控制策略。
“其中很多仍处于‘玩具’系统阶段，”德国维尔茨堡亥姆霍兹 RNA 感染研究研究所的生物工程师 Chase Beisel 说。“但至少概念是存在的。”
未决问题
随着生物工程师继续修补反 CRISPR 蛋白，以及 Acrigen 等公司开始将抑制剂引入治疗平台，一些生物学家也开始努力解决关于 CRISPR-Cas 系统最初进化的更深层问题。如果具有完整 CRISPR 保护的细菌通常携带噬菌体衍生的抑制剂序列来中和这种免疫力，那么“CRISPR 显然在许多情况下没有发挥其防御作用”，英国埃克塞特大学研究 CRISPR 系统生态学的 Edze Westra 说。然而，自然选择似乎保持系统正常运行。因此，他问道，“除了为生物技术初创公司提供资金外，它的作用是什么？”
一些研究表明，细菌使用 CRISPR-Cas 系统形成生物膜、修复 DNA 和进行其他参与增强毒力的调控过程。多伦多大学微生物学家 Maxwell 说，一旦反 CRISPR 蛋白消除了 Cas 酶的 DNA 切割能力，细菌就可能已将基因编辑器重新用于其他用途。
这些令人困惑的谜团不会阻止 CRISPR 基因编辑稳步迈向人类疗法、害虫控制等领域。对于许多人来说，这就是反 CRISPR 蛋白如此重要的原因。
“需要进行这种转变，以真正控制这些编辑器，以确保您获得所需的更改，而不会发生其他任何情况，”Doudna 说。她指出，正如开启生物技术革命的 CRISPR-Cas 系统始于实验室中的一些好奇的观察一样，抑制剂的发现也始于此，这可能是一种急需的纠正措施。
本文经许可转载，并于2020 年 1 月 15 日首次发布。