当我们中的两人（兰格和瓦坎蒂）在10年前最后一次为本杂志撰写关于组织工程前景的文章时，通过遵循工程原理并将非生物材料与细胞结合来“构建”活体组织的想法，对许多人来说听起来仍然很奇妙。然而，对于可移植的人体组织以替代、恢复或增强器官功能的需求，过去是、现在仍然是迫切的。如今，美国有近 5000 万人因各种形式的人工器官疗法而得以存活，发达国家中每五个 65 岁以上的人中就有一个很可能在其余生中受益于器官替代技术。
目前的器官替代技术，如全器官移植和肾透析机，已经挽救了许多生命，但它们是不完善的解决方案，给患者带来了沉重的负担。工程生物组织是可定制的和免疫相容的，因此有可能在器官衰竭患者的生活中产生重大影响。它们也可以满足其他人类需求，例如，作为“芯片上的器官”用于测试候选药物的毒性。
工程组织可以采取多种形式，从细胞聚集体或薄片到复杂的厚组织结构，以及最终的工程挑战，即整个功能器官。自从我们最初提出创建这些可植入组织的障碍以来[参见 Robert S. Langer 和 Joseph P. Vacanti 合著的《组织工程：未来的挑战》，《大众科学》，1999 年 4 月]，科学家们已经取得了相当大的进展。皮肤替代品和软骨替代品等产品已经帮助了成千上万的患者。人工组织，如膀胱、角膜、支气管和血管，正在进行临床试验。而构建更复杂组织结构的实验室工作正在产生令人鼓舞的结果。
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尽管我们 10 年前描述的一些障碍仍然存在，但在过去十年中，从对人体在胚胎发育和自然伤口愈合过程中自然构建组织方式的新见解中，取得了重大进展。组装组织结构的工程方法也变得更加成熟，可用于此任务的材料的化学、生物和机械性能也变得更加成熟。因此，该领域正在走向成熟，组织工程产品正日益成为医疗的现实选择。
输送生命之血
皮肤和软骨等组织成为首批准备进行人体测试的组织的原因之一是，它们不需要广泛的内部脉管系统。但大多数组织都需要，而提供血液供应的困难始终限制了工程组织的大小。因此，许多科学家专注于设计血管并将它们整合到工程组织中。
任何厚度超过几百微米的组织都需要血管系统，因为组织中的每个细胞都需要足够靠近毛细血管，以吸收不断从这些微小血管中扩散出来的氧气和营养物质。当被剥夺这些燃料时，细胞很快就会受到不可修复的损害。
在过去的几年里，人们设计了许多构建血管的新方法——既在组织外部，也在组织内部。许多技术依赖于对内皮细胞（形成毛细血管并排列较大血管的细胞）环境需求的更好理解，以及在极小尺度上雕刻材料的先进能力。例如，当将内皮细胞铺设在脚手架材料床上时，该材料的表面图案化有纳米级凹槽——是人类头发直径的千分之一——它们被鼓励形成毛细血管状管网络[购买数字版以查看相关侧边栏]。这些凹槽模仿了内皮细胞在形成天然血管时所靠的身体组织的纹理，从而提供了重要的环境信号。
微细加工是一套用于蚀刻计算机和手机的微电子芯片的技术，也被用于制造毛细血管网络。例如，瓦坎蒂与马萨诸塞州剑桥市德雷珀实验室的杰弗里·T·博伦斯坦合作，在可降解聚合物支架内直接生成了模仿组织毛细血管网络的微通道阵列。在这些通道内，可以培养内皮细胞以形成血管，同时也可以作为天然屏障，最大限度地减少血液对支架材料的污染效应。另一种方法是使用膜过滤器将载血通道与组织构建体中的功能细胞分离[购买数字版以查看相关侧边栏]。
另一种使细胞和血液分离但又足够接近以交换各种分子的方法是将它们悬浮在水凝胶中，水凝胶是由聚合物的水合网络制成的凝胶状材料。水凝胶在化学上类似于组织内所有细胞周围的天然基质。功能细胞可以封装在材料内部，并且穿过凝胶的通道可以用内皮细胞排列，以工程化具有原始脉管系统的组织样结构。
耶鲁大学劳拉·尼克拉森和兰格实验室的研究表明，通过将播种了平滑肌细胞和内皮细胞的支架暴露于生物反应器内的脉动条件下，可以生成较大的血管。在这种环境中制造的动脉被设计为模拟血液在体内血管中的流动，具有机械强度，并在移植到动物体内后仍能发挥功能。除了使组织工程师能够将此类血管整合到更大的构建体中之外，工程管本身也可以为动脉粥样硬化患者的搭桥手术提供移植物。
尽管在体外工程化毛细血管样结构和较大血管的能力是一项重大突破，但如果构建体要存活，工作中的工程组织植入物必须迅速与接受者自身的血液供应连接。因此，诱导身体形成新的脉管系统是这项工作同样重要的方面。例如，哈佛大学的戴维·穆尼已经证明，从聚合物微球或支架材料本身控制释放化学生长因子可以促进血管的形成，从而穿透植入的组织构建体。
兰格和瓦坎蒂所属的 Pervasis Therapeutics 公司正在进行高级临床试验，其中将这一原理的一种变体应用于血管损伤的愈合。将含有平滑肌和内皮细胞的三维支架移植到损伤部位附近，以提供生长刺激信号并促进受损血管的自然重建[购买数字版以查看相关侧边栏]。
尽管取得了这些进展，但在制造大型血管化组织和血管移植物方面仍然存在许多挑战，科学家们尚未完全解决这个问题。新的血管生长和渗透植入的组织构建体的速度很慢，导致许多构建体的细胞在植入后立即因缺乏血液供应而死亡。出于这个原因，包括在组织构建体内部预制血管系统的组织工程方法对于大型移植非常可能是必要的。这种预制血管也可以与血液血管募集生长因子的控制释放相结合，以诱导构建体血管的进一步生长。
由于整合工程脉管系统和宿主脉管系统也至关重要，研究人员需要更好地了解宿主组织细胞和植入细胞之间的串扰，以促进它们的连接。这种破译细胞彼此之间以及与其环境交换的更多信号的需求也延伸到构建成功的组织植入物的其他方面，例如选择最佳的生物原材料。
合适的细胞
在大多数情况下，从患者自身的细胞构建可植入组织将是理想的，因为它们与该人的免疫系统相容。实际上，此类植入物也可能面临较少的监管障碍，因为该材料来源于患者自身的身体。然而，正常细胞在培养中繁殖的能力是有限的，这使得难以生成足够的组织用于植入。来自患者自身身体或捐赠者的所谓成体干细胞在某种程度上更多产，并且可以从许多来源分离出来，包括血液、骨骼、肌肉、血管、皮肤、毛囊、肠道、大脑和肝脏。
然而，成体干细胞——它存在于成体组织中，并且能够产生多种细胞类型，这些细胞类型是其天然组织的特征——难以识别，因为它们看起来与普通细胞没有太大区别。因此，科学家必须寻找独特的表面蛋白质，这些蛋白质充当分子标记来标记干细胞。识别额外的标记物将大大简化在组织工程应用中与成体干细胞合作的工作。幸运的是，在过去的几年里，已经取得了许多重大进展，包括开发分离细胞和诱导它们在培养中增殖和分化成各种组织类型的新方法。
值得注意的是，宾夕法尼亚大学的克里斯托弗·陈和丹尼斯·迪舍都证明，通常来源于肌肉、骨骼或脂肪的间充质干细胞将对来自周围环境的机械线索作出反应。已经证明，它们会分化成最类似于其生长的基质材料的刚度的组织。其他研究人员也表明，来自基质和周围环境的化学信号对于指导成体干细胞分化成一种或另一种组织类型非常重要。然而，科学家们对于成体干细胞是否能够产生其自身组织家族以外的细胞存在分歧——例如，间充质干细胞是否可以产生肝细胞。
与成体干细胞相比，胚胎干 (ES) 细胞易于在培养中扩增，并且可以分化成人体所有细胞类型。兰格与以色列理工学院（位于海法）的舒拉米特·莱文伯格及其同事一起证明，甚至可以在组织工程支架上直接使 ES 细胞分化成所需的组织类型。这种能力表明有可能直接从分化的 ES 细胞在支架上制造 3-D 组织。然而，这些细胞确实存在各种挑战。
将 ES 细胞均匀分化成所需的细胞类型仍然非常困难。为了模仿 ES 细胞复杂的自然微环境并优化它们的分化，研究人员正在同时测试许多条件，以找到来自不同材料和基质化学物质的正确线索组合。他们还在筛选各种小分子以及信号蛋白，以识别控制“干性”的因素——细胞在保持自身未分化状态的同时产生分化后代的能力，随时准备根据需要产生更多新细胞。
这些见解也可以应用于生产具有胚胎细胞能力但缺点较少的细胞。除了刚才概述的困难之外，科学家仍然无法预测移植的干细胞在患者体内的行为。例如，未分化的 ES 细胞会形成肿瘤，如果细胞在移植前未全部成功分化，则会产生癌症风险。此外，研究人员一直在努力解决从人类胚胎中获取 ES 细胞相关的伦理问题，方法是探索从非胚胎来源生产 ES 样细胞的方法。
在过去的几年里，在从常规成体身体组织（如皮肤细胞）生产 ES 样细胞方面取得了显著进展。这些经过改造的细胞，称为诱导多能干 (iPS) 细胞，正在成为 ES 细胞令人兴奋的替代品，作为组织工程的可再生资源。2007 年，当时在京都大学的山中伸弥*和威斯康星大学麦迪逊分校的詹姆斯·A·汤姆森首次表明，通过重新激活一些被认为构成干性基础的遗传途径，可以将成体组织细胞转化为原始 iPS 状态。
例如，将少至四个主要调控基因重新引入成体皮肤细胞，就会导致细胞恢复到原始胚胎细胞类型。早期的实验使用病毒将这些基因插入细胞，这种技术对于用于患者的组织来说太危险了。最近的研究表明，可以调整一种更安全的非病毒技术来激活相同的干性基因库，甚至激活单个调控基因可能就足够了。该领域的快速进展使组织工程师充满希望，患者自身的细胞，被赋予 ES 细胞能力，可能很快就会成为构建组织构建体的理想材料。即使在我们试验这些不同细胞类型的同时，组织工程师也在改进我们的构建方法。
建筑学进展
十年前，研究人员假设细胞是聪明的：如果我们把正确的细胞类型彼此靠近放置，它们就会“弄清楚”如何形成它们的天然组织。在某种程度上，这种方法是有效的，但我们现在更欣赏器官和组织发育以及正常功能期间细胞及其周围环境之间交换的信号的复杂性，并且我们知道在我们的构建体中提供定制环境的重要性。
此外，身体中的每个组织都执行工程替代物必须能够执行的特定任务，我们正在学习尽可能紧密地复制相关组织的潜在生物学对于生成能够执行其预期功能的组织至关重要。在更复杂的器官中，多种细胞类型协同工作——例如，在肝脏中，细胞的工作包括解毒和营养分解。因此，必须在组织工程构建体中重新创建组织的微观结构和细胞相对于彼此的定位，以重现所需的功能。
早期的组织工程工作使用由各种材料制成的支架来尝试复制组织的 3-D 形状，并粗略地近似这种空间细胞组织。过去几年中的许多进展提高了工程组织的复杂程度，并更紧密地再现了组织环境。例如，已经通过去除天然组织中的所有细胞来制造支架，仅留下结缔组织纤维。这些外壳可用于生长工程组织，这些组织可以重新创建原始组织的很大一部分功能。在一项特别令人印象深刻的研究中，用心脏细胞和内皮细胞播种的脱细胞啮齿动物心脏支架产生了心脏肌肉纤维和血管结构，这些结构生长成跳动的心脏。
各种“打印”技术也可以用于精确排列细胞。通过修改标准喷墨打印机，工程师可以分配细胞本身或支架材料，以生成组织或细胞可以在其上播种的框架。模仿组织的自然地形也有助于引导细胞，另一种从工程世界借用的技术，静电纺丝，可以生产类似于天然组织基质纹理的支架。纺制非常细的聚合物纤维以形成网状支架，这为细胞提供了更自然的 3-D 环境，并且可以精细地控制聚合物材料的化学和机械特性。塔夫茨大学的戴维·卡普兰用类似于蜘蛛网的丝绸材料制成了类似的支架，以生成韧带和骨组织。
由于水凝胶的生物、化学和机械特性可以很容易地控制，因此凝胶被证明可用于支持和包裹细胞，同时增强所得组织的功能。含有活细胞的水凝胶可以“打印”或以其他方式排列和分层，以描绘正确的组织结构。例如，我们中的一位（卡德姆侯赛尼）已经表明，水凝胶包裹的细胞聚集体可以模制成任意数量的互补形状[购买数字版以查看相关侧边栏]，然后汇集在一起以自组织成更大的复杂图案。这种技术可用于复制组织（如肝脏）中细胞的自然组织，肝脏由六边形结构组成，每个六边形结构都包含围绕中央血管的毒素过滤细胞。
一些凝胶的设计使其聚合物响应紫外线而连接在一起，从而可以雕刻所需的构建体形状，然后通过将构建体的全部或部分暴露于光线下使其固化。科罗拉多大学博尔德分校的克里斯蒂·安塞思和约翰霍普金斯大学的詹妮弗·埃利塞夫使用这种光交联水凝胶生成了软骨和骨组织。凝胶也可以注入许多信号分子，以促进组织生长或分化。西北大学的塞缪尔·斯图普已经表明，神经干细胞在水凝胶内分化成神经元，该水凝胶包含充当环境信号的小蛋白质，指导细胞的行为。斯坦福大学的海伦·M·布劳也使用了含有细胞外基质成分的水凝胶来控制和研究单个干细胞的特性。
最后，纳米技术已被用于生成适用于移植的工程细胞片。东京女子医科大学的冈野辉夫已经生产出涂有温度响应聚合物的表面，当温度从 37 摄氏度降至 20 摄氏度时，该聚合物会膨胀。首先诱导细胞在这些纳米工程表面上形成单层，然后降低温度以膨胀下面的基质并分离完整的细胞片。然后可以将这些细胞片（包含适当的细胞分泌基质分子）堆叠或卷起来以构建更大的组织构建体。
尽管这些进展大大改进了可以生成的支架的范围和多样性，但该领域仍然存在挑战。一个困难是缺乏对各种组织发育和伤口愈合特定阶段存在的生长因子和细胞外分子浓度和组合的了解。需要更好地了解这些设计参数，以工程化模仿身体自身愈合和发育的组织。因此，组织工程师正在向其他领域寻求见解，包括对发育组织和再生伤口中基因和蛋白质相互作用的研究。将这些发现与先进的培养系统相结合，正在帮助我们更好地控制体外细胞的反应，但还需要取得更多进展。
走向成熟
尽管存在我们已经描述的持续挑战，但工程组织不再是虚幻的前景。简单的制造组织已经投入临床使用，这种恢复或替代生物功能的方法现在有望成为数百万有需要的患者的可行疗法。截至 2008 年底，各种组织工程产品的年销售额接近 15 亿美元。
鉴于在我们上次为本杂志撰写关于组织工程前景的文章后不久该领域遭受的挫折，这些数字更加令人印象深刻。在 1990 年代末和 2000 年代初期，热情和投资都很高，但随着互联网金融泡沫的破裂，生物技术初创企业的资金减少了。即使是拥有食品和药物管理局 (FDA) 批准的组织工程产品的公司，也必须重组其商业模式，推迟其产品上市。由于工程组织由细胞、生物活性化学物质和非生物支架材料制成，因此构建体必须经过 FDA 的严格分析，这既昂贵又耗时。资金的缺乏使公司更难进行广泛的临床试验。具有讽刺意味的是，某些组织工程产品的商业化延迟有一个好处——它为科学成熟和商业方法变得更加成熟赢得了时间。
仍然有改进的空间。获得 FDA 批准仍然是一个主要障碍，部分原因是来自不同人的细胞可能表现不同，并且接受者对同一种植入物的反应也可能不同。这种不可预测性可能使 FDA 难以确定给定的工程构建体是安全有效的。因此，进一步的研究对于衡量和理解个体之间的差异，并在研究组织工程产品的临床试验中考虑这些差异非常重要。未来的商业模式必须包括与这项工作相关的广泛成本。
尽管如此，凭借最近对组织如何发育以及身体如何自然修复自身的见解，组织工程师现在正致力于创造第二代产品，这些产品在机械、化学和功能上都比以往任何时候都更接近其生物对应物。即使在当今紧张的经济环境下，我们预计对纳米技术、干细胞生物学、系统生物学和组织工程的研究将很快融合，为设计当今如此多的人需要的复杂器官替代物产生新的想法。
这篇文章最初以“组织工程进展”为标题印刷
*注（2009 年 4 月 21 日）：自发布以来，山中伸弥的名字拼写已更正。