在10年前举行的一场正面交锋的竞赛中，美国国立卫生研究院的科学家测试了两种有前景的新型疫苗，以观察哪种疫苗可能对地球上最致命的病毒之一，即导致艾滋病的HIV（人类免疫缺陷病毒）提供最强的保护。其中一种疫苗由称为质粒的DNA环组成，每个质粒携带五种HIV蛋白质之一的基因。其目标是让接受者的自身细胞制造病毒蛋白，希望它们能激起免疫细胞的保护性反应。第二种疫苗没有使用质粒，而是使用了另一种称为腺病毒的病毒作为单一HIV基因的载体，该基因编码一种病毒蛋白。这种组合的基本原理是使用一种“安全”病毒来引起免疫细胞的注意，同时引导它们对HIV蛋白产生反应。
我们中的一位（韦纳）已经研究DNA疫苗八年了，并希望能够充分证明质粒诱导针对可怕病原体免疫力的能力。然而，测试结果对第一代DNA疫苗的信徒造成了重大打击。DNA接受者对五种HIV蛋白仅表现出微弱的免疫反应或根本没有反应，而基于腺病毒的疫苗的接受者则有强烈的反应。对于学术界和制药公司的研究人员来说，腺病毒显然看起来是开发HIV疫苗更有力的候选者。
对于DNA疫苗研究人员来说，结果并非完全出乎意料，因为在之前的一些试验中已经观察到不良反应。尽管如此，这些失败还是令人失望的，因为我们有充分的理由期望质粒疫苗既安全又有效。科学家们确信最初的概念仍然有力，因此回到绘图板，寻找提高该技术有效性的方法。现在，这些努力开始获得回报。新一代基于质粒的疫苗在人体和动物试验中证明，它可以在产生预期反应的同时，保持DNA如此吸引人的安全性和其他优点。相同的DNA技术现在也扩展到其他形式的免疫疗法和药物的直接递送。成熟形式的此类DNA疫苗和疗法有望通过解决目前缺乏有效治疗的多种疾病而取得成功。
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过去和现在的好主意
当20世纪90年代初利用DNA为人类免疫的概念开始受到关注时，其优雅的简洁性立即显而易见。疫苗的核心成分——构建用于携带编码来自一种或多种病原体的蛋白质的基因的质粒——会诱导接受者的细胞制造这些蛋白质，但不会携带制造整个病原体的指令，因此疫苗不会产生病原体本身。
当质粒进入宿主细胞（称为转染）时，通常解码DNA的机制开始读取质粒的基因并制造所需的蛋白质，蛋白质最终从细胞中释放出来，很像病毒颗粒。在细胞外，病原体特异性蛋白质被免疫细胞识别为外来物质。因此，免疫系统应该被欺骗，认为身体被感染，从而引发针对外来蛋白质的长期免疫识别和反应。仅仅引入携带一个基因的DNA环就可以诱导免疫力，从而抵抗整个病原体。
除了安全性和简便性之外，DNA疫苗还具有优于其他类型疫苗的许多优点。它们的生产速度明显快于某些传统疫苗，例如需要处理和培养“活”病毒且生产过程至少需要四到六个月的流感疫苗。DNA在室温下本质上是稳定的（这对我们的细胞来说很幸运），因此DNA疫苗不需要持续冷藏，这在许多疫苗的运输和储存过程中是一个令人担忧的问题。
从疫苗设计者的角度来看，DNA还有另一个优点，近年来，这个优点在重新打开这项技术的大门方面发挥了重要作用。免疫系统不会将质粒视为外来物质——毕竟，它们是由DNA制成的——因此疫苗本身在技术上不会引起任何免疫反应。只有质粒基因编码的蛋白质，一旦由细胞制造出来，才会引起免疫哨兵的注意，这意味着质粒可以一次又一次地在同一接受者中使用，以递送多种基因，而无需担心身体会对DNA载体产生免疫力并攻击疫苗本身。
不幸的是，在早期的DNA疫苗测试中，免疫反应微弱的问题是一个重大缺陷。这些失败的主要原因似乎是疫苗质粒没有进入足够的细胞，而且即使进入了细胞，细胞也没有产生足够多的编码蛋白质。结果，免疫系统没有得到充分的刺激。
然而，竞争技术最终将面临更大的问题。2007年，制药公司默克启动了一项大型HIV疫苗试验，该疫苗使用一种称为AdHu5的腺病毒来递送HIV病毒基因。鉴于之前使用腺病毒的实验中观察到的强烈免疫反应，人们对这项名为STEP试验的开始抱有很大的希望和兴奋。总共有大约3000名HIV阴性个体接受了疫苗或安慰剂注射。
然而，随着试验的进行，两组之间开始出现令人不安的差异：接种疫苗的人的保护效果并不比接受安慰剂的人好，最终他们似乎更容易感染HIV。早期统计发现，疫苗组914名男性中有49人感染了HIV，而安慰剂组922名男性中有33人感染了HIV。意识到这一点后，STEP试验于2009年夏天被停止。数据仍在分析中，以寻找造成这种情况的线索，但一些证据表明AdHu5载体可能是其中一个可能的混淆因素。在对AdHu5（一种常见的感冒病毒）具有预先存在免疫力的人群中，免疫系统可能攻击了疫苗本身。为什么一些疫苗接受者似乎更容易感染HIV仍然不清楚。
DNA的重生
在STEP试验之前的几年里，仍然坚信DNA平台潜力的研究人员一直在努力开发解决方案，以解决第一代质粒疫苗的复杂问题。这些努力的重点是提高质粒活性的所有方面，包括将它们导入细胞的新方法、提高它们进入细胞后蛋白质产量的新方法，以及增强免疫系统对疫苗编码蛋白质反应的疫苗添加剂。
新的疫苗递送方法是这项工作中最重大的成就之一，因为它们使更多细胞——包括免疫细胞本身——吸收质粒。例如，透皮贴剂和其他无针系统，如Gene Gun和Bioject，它们使用加压空气注射疫苗，将质粒递送到皮肤中，在那里，称为抗原呈递细胞的免疫哨兵高度集中。这些方法还比针头注射将质粒物理性地强行导入更多细胞。为了在使用针头注射到肌肉或皮肤中的疫苗中获得类似的结果，注射后可以进行电穿孔，这是一系列电脉冲，可使细胞膜暂时打开孔隙，使质粒更容易进入。电穿孔可以将细胞对质粒的吸收量提高多达1000倍。
质粒-基因构建体本身也通过对其携带基因的DNA序列进行多种类型的改进而得到改进。例如，密码子优化涉及以细胞最容易执行的方式拼写基因的指令。在遗传密码中，蛋白质的氨基酸构建块由构成密码子的三组DNA“字母”指定。某些氨基酸由多个密码子指定，但细胞通常偏爱其中一个同义密码子，并且比其他密码子更有效地翻译它。因此，选择最佳密码子可以提高细胞产生所需蛋白质的产量。对基因序列的其他修改可以提高细胞实际读取以制造蛋白质的信使RNA基因转录本的稳定性和准确性，并可以加快蛋白质的制造速度。
基因起始附近的一个所谓的引导序列是细胞首先翻译成蛋白质分子起点的序列，优化基因的引导序列可以提高最终蛋白质分子的稳定性。某些引导序列甚至可以将蛋白质标记为细胞应该分泌的蛋白质，这是理想的，因为它允许免疫细胞在转染细胞内部和外部都遇到外来蛋白质。这两种情况会引发略微不同的免疫反应类型，并且这种组合增强了疫苗产生的整体免疫力。
最后一项重要的改进涉及称为佐剂的物质，佐剂通常添加到传统疫苗中以增强免疫系统反应。在某些情况下，如果需要，佐剂甚至可以将免疫系统引导到一种形式的反应而不是另一种形式的反应，例如，倾向于更多地产生T细胞（T细胞在体内寻找并杀死病原体感染的细胞），而不是更多地产生抗体蛋白（抗体蛋白试图阻止病原体进入细胞）。例如，一种名为Vaxfectin的化合物已被证明可以将针对流感的DNA疫苗的抗体反应提高200倍。另一种佐剂——Resiquimod——与某些DNA疫苗一起使用，以引发包括T细胞和抗体的强烈免疫反应。
基于DNA的技术的另一个引人注目的方面是，设计者可以将佐剂分子的基因直接整合到疫苗质粒中，而不是将佐剂添加到最终疫苗制剂中，这有时会引起人们对保持制剂的适当乳化或稳定性的担忧。吸收质粒的细胞随后将与疫苗蛋白一起制造编码的佐剂。当基因编码的佐剂被添加到DNA疫苗中时，即使质粒已经按照之前的描述进行了优化，佐剂也可以进一步将免疫反应提高五倍或更多。
这些设计者质粒疫苗与DNA平台早期简单的蛋白质编码构建体截然不同。凭借优化的质粒和改进的递送方法，该技术已准备好在STEP试验开始时卷土重来。更重要的是，DNA方法已经开始显示出超越经典疫苗接种的用途前景，包括质粒递送某些药物和针对癌症的免疫疗法。
多用途技术
安全地将基因递送到细胞中并让这些细胞有效地制造编码蛋白质的能力为许多潜在的治疗方法开辟了道路。事实上，在广泛临床应用竞赛中，这些基于DNA的疗法中的许多疗法都领先于DNA疫苗。与通常以小化学分子形式出现的经典药物不同，DNA疗法递送基因来治疗疾病。然而，与传统的基因疗法不同，质粒不会永久整合到接受者的细胞基因组中，甚至不会永久保留在细胞中，这避免了阻碍基因疗法进展的并发症。
与新技术通常的情况一样，基于质粒的疗法最早的成功是在动物身上。一个已经获得许可用于猪的例子旨在预防胎儿流失。与电穿孔一起施用于怀孕母猪的质粒进入母猪的细胞，然后细胞产生一种激素（生长激素释放激素），该激素支持妊娠胎儿的存活。这种治疗方法的成功部分令人兴奋，因为它只需要单次注射即可在如此大的动物身上起作用，这对人类疗法来说是个好兆头。
目前正在进行各种大型人类DNA疗法临床试验，包括一项递送称为生长因子的蛋白质基因的试验，这些蛋白质动员干细胞来治疗充血性心力衰竭。另一项试验采用编码称为IGF-1的生长因子的质粒来治疗患有X连锁重症联合免疫缺陷症的患者的生长障碍。第三项试验解决了一个众所周知的难以治疗的循环系统问题，称为危重肢体缺血。该疗法递送质粒编码因子，诱导新血管生长，以期避免截肢的需要。
另一类称为DNA生物免疫疗法的治疗方法，结合了DNA疗法和疫苗的最佳方面，通过递送诱导身体对现有疾病（如肿瘤或慢性病毒感染）产生免疫反应的基因。例如，一项早期试验使用DNA编码病毒蛋白，以诱导免疫细胞攻击由人乳头瘤病毒（HPV）引起的肿瘤。该试验的初步结果表明，一半的接受者能够对HPV蛋白产生T细胞反应，超过90%的接受者产生高水平的抗体。目前正在进行的另一项试验正在测试针对丙型肝炎病毒的DNA免疫疗法。这两项试验令人鼓舞的初步结果意义重大，因为目前尚无针对HPV肿瘤或丙型肝炎的有效免疫疗法。
在这个领域，兽医应用再次比人类研究更先进，一种成功的犬黑色素瘤DNA疗法让研究人类癌症的研究人员感到兴奋。梅里亚尔公司生产的犬黑色素瘤疗法，与未治疗的犬相比，晚期黑色素瘤犬的中位生存时间延长了六倍。这种DNA生物免疫疗法证明了新一代DNA平台有潜力在以前的方法未能成功的地方取得成功。
回到未来
在过去的10年中，已经进行或正在进行数十项人类DNA疗法和疫苗的临床试验。流感疫苗的质粒版本例证了DNA方法已经证明的一些好处。我们研究小组开发的一种流感疫苗，目前正处于早期人体试验阶段，在动物实验中被证明可以抵抗常见的流感病毒株以及已感染数百人的高致命性H5N1禽流感。该疫苗能够提供如此广泛的保护，是因为其质粒包含所谓的流感病毒基因共有序列，这意味着由此产生的病毒蛋白类似于许多不同流感病毒株的病毒蛋白。此类疫苗可能意味着季节性流感疫苗与每年出现的新流感病毒株之间不匹配的终结。
当然，去年出现的新型H1N1流感病毒株引发了全球大流行，凸显了对新型疫苗方法的迫切需求。制药公司Vical制造的实验性DNA版H1N1疫苗于2009年5月仅用两周时间完成。如果这种疫苗提前经过测试和获得许可，则至少可以比标准疫苗上市早两个月大量生产。目前该疫苗正处于早期人体试验阶段，结果令人鼓舞。
DNA疫苗和疗法靶向其他有效替代疗法的疾病的潜在能力，也使DNA重新回到HIV疫苗竞赛中。目前正在人体试验中的一种疫苗Pennvax-B包含三种HIV病毒基因以及编码佐剂分子的基因，并通过电穿孔递送。还有两种疫苗正在一项策略中进行测试，该策略使用质粒来启动免疫细胞识别HIV蛋白，然后施用另一种疫苗类型以将早期免疫反应提高到更高水平。其中一种疫苗GeoVax，正在与一种基于称为改良痘苗病毒安卡拉的病毒的疫苗一起给予作为加强剂。具有讽刺意味的是，美国国立卫生研究院疫苗研究中心现在正在测试一种不同的基于DNA的HIV疫苗，并使用两种基于腺病毒的HIV疫苗之一作为加强剂。
几种DNA疫苗和疗法已经用于动物，并且正在进行涉及难以治疗的疾病的大型、后期人体试验，这一事实证明了质粒技术已经取得了多大的进步。过去十年该领域的巨大进步已经将一些最具创造性的疫苗和疗法带入临床测试，以造福人类。在这方面，我们这些自这项技术诞生之初就对其进行培育的人不禁感到自豪，看到它已经摆脱了艰难的童年，并且可以期待光明的未来。