就像人们通过 Twitter、Facebook 和 LinkedIn 分享新闻一样，细胞也利用多种信息交换模式。有些细胞释放激素，通过血液广泛传播；另一些细胞释放神经递质，在神经元之间传递信号。但几乎所有细胞，事实证明，都通过大量的通道与邻居建立网络，这些通道直接连接一个细胞的内部和下一个细胞的内部。
20世纪60年代中期，研究人员戏剧性地瞥见了这种细胞间通讯的形式，当时他们将荧光染料分子注入到密密麻麻的细胞群中的单个细胞中。通过显微镜观察，他们看到荧光从一个细胞迅速扩散到下一个细胞，直到有时组织中数百个细胞都发出光芒。之前的研究表明，离子可以在相邻细胞之间传递电信号。但是，观察到染料分子的扩散（染料分子很小，但比离子大），无疑证实了细胞拥有通道，分子可以通过这些通道在相邻细胞之间大量传递。
生物学家现在知道这些通道无处不在。它们大量存在于所有动物（包括人类）的组织中，在那里它们参与了各种各样的功能。这些集合，称为间隙连接，有助于同步心脏肌肉细胞的跳动和分娩时子宫的收缩。间隙连接使眼睛能够适应不同的光照水平。它们甚至在胚胎发育过程中的器官形成中也发挥作用。
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在过去的20年里，科学家们发现间隙连接的组装或活动缺陷会导致一系列人类疾病，包括听力丧失、白内障、皮肤病、神经系统疾病、心脏病甚至某些癌症。影响内耳间隙连接组成蛋白的单个突变导致高达 40% 的遗传性耳聋患者出现听力丧失。并且与间隙连接相关的新的疾病一直在被发现——仅在过去几年中就发现了几种，包括一种儿童癫痫。
现在，研究正在为间隙连接的构建方式提供令人兴奋的见解，并且它们开始揭示间隙连接组装和活动的破坏如何引发疾病。这些发现应该为许多疾病带来新的疗法，这些疾病是由于细胞无法再共享“内部”信息而导致的。
搭建桥梁
早在早期的染料注射实验进行时，研究人员并没有从医学相关性的角度进行思考。在 20 世纪 60 年代和 70 年代，他们专注于揭示更多关于细胞之间这种神秘的邻居到邻居的通讯的证据，并更多地了解其特性。在间隙连接被识别和命名之前，生理学家发现这种分子信息的共享发生在各种器官和生物体中，从鱿鱼胚胎和电鱼到各种哺乳动物细胞。他们证实，分子确实在细胞膜紧密物理接触的点上直接在细胞之间移动。
到 20 世纪 60 年代后期，科学家们的目标是确定通道的外观以及它们如何形成。早期的显微镜研究表明，在两个相邻细胞的膜紧密贴合的地方存在大的、扁平的斑块。在这些连接处，细胞之间似乎被一个非常薄的间隙隔开，只有几纳米宽，这导致该结构被称为间隙连接。即使在研究人员发现这个狭窄的空间并非空旷，而是充满了连接一个细胞到另一个细胞的通道的部分之后，这个名称仍然沿用至今。
为了探索这些扁平膜斑块在染料和电学实验中看到的“细胞连接性”中所起的作用，我们中的一位（Johnson）开始研究这些连接组装时会发生什么。约翰逊与他在明尼苏达大学的同事一起，轻轻地将源自肝肿瘤的培养细胞分离，然后将它们重新混合在一起。几分钟之内，扁平的斑块出现在细胞膜上，但仅出现在两个细胞接触的地方。这一观察证实了一种怀疑，即间隙连接的组装是一个联合项目，需要相邻细胞的合作。随着这些扁平斑块的扩展和成熟，细胞之间通过的电流也增加了。这些连接似乎可以促进离子的交换。
约翰逊和他的团队剥离了连接细胞的膜以进行仔细观察，看到了似乎是大量颗粒积聚在扁平斑块内。后来证明，这些颗粒是构成间隙连接的基石的通道。每个通道都由称为连接蛋白的分子形成，连接蛋白属于 20 世纪 80 年代后期鉴定出的一类蛋白质。
六个连接蛋白结合在一起形成一个称为半通道的甜甜圈状结构。这个半通道被插入到细胞的外膜中，在那里它可以与相邻细胞中的半通道相互作用。当这些匹配的半通道中的连接蛋白相互作用时，它们形成一个连续的孔，以一种方式连接细胞，使一个细胞的细胞质与另一个细胞的细胞质直接通讯。实际上，这个孔是单个间隙连接通道，数百或数千个通道聚集在一起形成每个间隙连接。
构建这些巨大的通讯集团对细胞来说是一项庞大的任务。单个间隙连接可以包含 10,000 个通道。由于每个间隙连接通道都涉及两个半通道，因此每个连接总共需要 120,000 个连接蛋白。仅心脏就包含数十亿个细胞，每个细胞都通过间隙连接与其几个邻居相互作用。换句话说，这些庞大结构的组装是分子工程的奇迹。
更令人惊奇的是，间隙连接不是永久性的，甚至不是长寿命的，而是不断地被拆卸和重建。研究表明，心脏间隙连接中一半的连接蛋白每两小时更换一次。在一天的时间里，人体心脏中的每个间隙连接很可能都被拆除并替换为新组装的通道。
鉴于这些非凡结构的复杂性，似乎必须存在系统来确保它们的构建顺利进行，以便细胞间通讯不会丢失。为了掌握这些调控机制，我们三个人都在研究间隙连接，选择结合我们的专业知识；特别是，我们想探索如何控制这些广泛的通讯通道的组装和移除。
走到一起
我们在加利福尼亚州太平洋格罗夫的阿西洛玛会议中心举行的间隙连接会议上喝咖啡时，制定了我们的合作计划。那是 1991 年，我们中的一位（Lampe）是约翰逊在明尼苏达大学实验室的博士后研究员，那里的重点已转向间隙连接组装的调控。我们三人组的最后一位成员（Laird），当时是加州理工学院 Jean-Paul Revel 实验室的博士后，刚刚开发出一组抗体分子，这些分子特异性地结合连接蛋白。这些抗体将使我们能够与连接蛋白相互作用，并了解分子的哪些部分对于间隙连接的形成和活动至关重要。
莱尔德的抗体识别出一种特殊的连接蛋白：Cx43。人类拥有编码 21 种不同连接蛋白的基因，每种细胞类型都产生自己独特的连接蛋白组。皮肤细胞雄心勃勃地制造多达九种不同的连接蛋白。然而，Cx43 是该家族中最广泛的成员，存在于许多器官中，包括皮肤、心脏、大脑、肺和骨骼。
像所有连接蛋白一样，Cx43 由四个跨膜片段组成，这些片段将蛋白质锚定在细胞膜中。蛋白质的尾部悬挂在细胞内部，包含各种元素，我们稍后将确定这些元素参与调节其活性和组装成通道和连接。蛋白质在膜中进出时形成的两个环突出到细胞之间的空间中。莱尔德产生的一些抗体靶向这些细胞外片段。
由于环从细胞表面伸出，因此认为它们可能充当类似魔术贴的钩子，使连接蛋白能够相互锁定，这似乎是合理的。为了检查这个假设，我们再次分离培养的细胞，然后将它们重新混合在一起——但这次我们添加了莱尔德的抗体。现在间隙连接根本没有形成；我们没有看到注射染料的细胞间转移，也没有看到发展中间隙连接的特征性扁平斑块。通过粘附在环上，抗体阻止了一个细胞中的连接蛋白与相邻细胞中的连接蛋白“对接”。
此类抗体研究表明，连接蛋白的附着对于间隙连接的构建至关重要。但是，需要一种不同的技术来实时观察连接蛋白在活细胞中的移动过程。
追踪蛋白质
1994 年，我们三个人发现自己再次聚在一起参加另一次会议——这次是在旧金山举行的美国细胞生物学学会会议。在关于我们听到的演讲的深夜聊天中，我们对绿色荧光蛋白 (GFP) 越来越兴奋——这是一种分子工具，其有用性最终将获得诺贝尔奖的认可。会议上的一位演讲者描述了她如何将这种荧光标记物连接到她最喜欢的蛋白质上，以追踪其在活细胞中的运动。因此，我们想知道我们的研究小组是否可以使用 GFP 来监测连接蛋白的运动。
我们首先将 GFP 贴在连接蛋白的尾端。令我们非常高兴的是，这种方法效果很好：标记的连接蛋白被正确地插入细胞膜中，在那里它们组装成功能性间隙连接，这些连接表现出几乎所有由未修饰的连接蛋白构建的连接的特性。我们现在有一种强大的方法来观察细胞内连接蛋白的行为——莱尔德在他的新职位上继续在西安大略大学进行这项工作。
我们的最初观察结果令人惊讶。我们最初每 10 分钟拍摄一次包含标记连接蛋白的细胞的图片，认为我们可以将这些静止图像拼接在一起制作成延时电影，突出显示连接蛋白的运动。但是连接蛋白移动得太快了，以至于我们无法分辨哪个蛋白质是哪个蛋白质，或者每个蛋白质去了哪里。我们每两分钟再次尝试，但这个时间范围仍然不够好。为了观察单个标记的分子在细胞周围移动，我们最终不得不每隔几秒钟收集图像。
由此产生的电影使我们不仅能够追踪连接蛋白，还能够观察半通道，因为它们沿着由称为微管的结构组成的分子轨道在细胞内运输。我们和其他人看到，较小的间隙连接可以结合形成较大的间隙连接——我们在电子显微镜研究中已经获得了一些暗示。我们还证明，较大的间隙连接可以分解形成较小的间隙连接，这是一种间隙连接重塑，发生在细胞生长、移动、弯曲和分裂时。
我们的同事设计了更多标记连接蛋白的方法，发现间隙连接通过在其周界添加半通道而生长——因此间隙连接的中心部分代表斑块的“最老”部分。这些较旧的成分似乎随着间隙连接的老化而被移除，这种观察结果可以解释间隙连接如何在其中连接蛋白丢失的情况下仍然存在；较新的通道向内拥挤以取代较旧的通道。
我们活细胞研究中最引人注目的发现也许是，当参与细胞之一基本上咬掉其邻居的一部分时，间隙连接也可以大块地被细胞回收，这是其他人根据一些早期的电子显微镜图像提出的机制。这种激进的操作会吞噬由两个细胞贡献的连接组件——这个过程可能提供一种安全可靠的方法，可以在不再需要时快速关闭两个细胞之间的通讯。这种大规模消除间隙连接实际上发生在分娩后的子宫中，从而禁用了已形成以协调收缩的通讯网络。
掌控
了解到间隙连接不断更新，我们接下来着手探索细胞如何监督这种大规模的分子重塑。早期的研究表明，称为激酶的蛋白质是调节剂。通过简单地向目标蛋白质添加磷酸基团，激酶可以改变该蛋白质的活性或在细胞内的位置。
我们的挑战是弄清楚蛋白质激酶是否也调节连接蛋白的行为，如果是这样，磷酸化究竟起什么作用。当 Lampe 于 1994 年在西雅图的弗雷德·哈钦森癌症研究中心建立他的实验室时，他在这一系列研究中发挥了主导作用。通过分解 Cx43 并一次检查蛋白质的一小部分，Lampe 和他的同事发现，在其生命周期中，这种连接蛋白在其尾部多达 15 个不同的位置被磷酸化。这些信息使我们能够找出控制含有 Cx43 的间隙连接形成的一些调控密码。当特定的激酶作用于蛋白质尾部的某些部分时，这种修饰会增强含有 Cx43 的连接的组装；作用于尾部不同部分的其他激酶会抑制连接的形成、活性或大小。
对调控密码的深入了解现在使我们能够检查人体组织样本，以寻找磷酸化变化如何改变间隙连接在损伤或疾病期间的组装和功能的线索。例如，我们和其他人已经开始确定，当心脏细胞试图从心脏病发作后的缺氧中恢复时，或者当皮肤细胞动员起来以愈合伤口或划痕时，通过间隙连接的通讯如何变化。在这两种情况下，Lampe 的团队都发现 Cx43 尾部的一个特定位点的磷酸化作用增强。这种磷酸化作用通过阻止 Cx43 与一种蛋白质（其他小组研究过）相互作用来短暂地增加这些组织中间隙连接的大小，该蛋白质限制了新连接蛋白整合到现有连接中的能力。间隙连接大小的由此增加有助于增加通讯——这在损伤后的最初几分钟内至关重要——并有助于保持心脏组织的功能并促进闭合开放性伤口所需的皮肤细胞的迁移。
了解磷酸化如何影响连接蛋白的组装和功能，以及间隙连接通讯如何响应损伤或疾病而变化，这为开发可以促进或抑制相关蛋白激酶活性的疗法打开了一扇门。然而，必须谨慎地追求此类治疗策略，因为在疾病的某个阶段增加间隙连接可能在后期被证明是有害的。例如，尽管间隙连接在损伤后立即短暂增大，但随后它们会被迅速降解以促进适当的愈合。在患有糖尿病的人中，Cx43 的持续过度产生会延缓伤口闭合。当角膜被划伤时，连接蛋白会促进炎症和疤痕形成，而不是愈合。在这些情况下，限制损伤周围细胞中 Cx43 的产生或功能可促进伤口快速修复而无疤痕——几种生物技术公司正在追求这种方法。
然而，为了充分利用我们对间隙连接生物学的知识来设计有效的疗法，研究人员需要更深入地了解连接蛋白如何在不同条件下在不同组织中聚集在一起，以及它们的聚集和活动如何在面对疾病时出错。对编码连接蛋白的基因中致病突变的研究开始提供一些有用的见解。
中断通讯
研究人员在 20 世纪 90 年代中期发现了连接蛋白可以参与疾病的第一个确凿的遗传证据。发现 Cx32 编码基因中的突变会导致一种称为 Charcot-Marie-Tooth 病的神经系统疾病。在这种疾病中，神经髓鞘中绝缘神经的间隙连接消失，导致髓鞘退化并导致神经退化；反过来，这种丧失会导致肌肉萎缩和虚弱，尤其是在四肢。
随着连接蛋白基因中的突变具有严重的生理后果的发现，间隙连接领域见证了研究人员和临床医生对确定这些疾病的遗传基础的兴趣激增。其他研究发现了新的连接蛋白突变，如今已知 14 种不同的疾病源于间隙连接连接蛋白的缺陷。
关于这一系列疾病最引人注目的事情是它们彼此之间的差异有多大。除了神经退行性 Charcot-Marie-Tooth 病外，连接蛋白中的突变还可能导致听力丧失、癫痫、心脏病、皮肤病、白内障和胚胎发育过程中出现的各种疾病。正如可能预期的那样，不同连接蛋白中的突变会导致不同的疾病。但是，在一个更令人惊讶的发现中，事实证明突变型连接蛋白不一定平等地影响所有组织或器官；如果在两个器官中产生特定的突变体，它可能会损害一个器官的功能，但不会损害另一个器官的功能。
许多研究小组正在努力理解这种现象。一种解释可能是，在某些组织中，其他健康的连接蛋白可以补偿缺陷变体，从而使间隙连接通讯以足够的水平继续进行。这种补偿机制可能发生在某些组织中，但不会发生在其他组织中。或者，也许特定的连接蛋白在一个组织中发挥一种作用，但在其他组织中发挥不同的作用，这取决于存在哪些其他连接蛋白。各种连接蛋白家族成员也可以混合，产生混合通道，这些通道可以促进不同分子信号的传递——其中一些信号在一个组织中比在另一个组织中更重要。
然而，对于某些连接蛋白，缺陷确实会损害多个组织。以我们研究的一种疾病为例，称为眼齿指发育不良 (ODDD)。患有这种疾病的人，由 Cx43 基因突变引起，表现出一系列症状，包括小眼睛、牙齿发育不良、面部和头部的骨骼畸形以及手指或脚趾之间的蹼状物。似乎这还不够，一些受影响的人会发展出一种皮肤病，这种皮肤病会在手掌和脚底产生增厚、鳞状的老茧。最近对连接蛋白生命周期的研究为解释为什么有些人比其他人患有更严重的疾病形式提供了一些暗示。
在 ODDD 患者中发现了 70 多个 Cx43 突变，我们首先探索这些突变对蛋白质的作用——以及它们如何影响间隙连接的构建。莱尔德和他的同事发现，Cx43 基因中的许多突变导致连接蛋白到达细胞膜，但不会形成功能性间隙连接；染料不会通过这些连接从细胞到细胞流动，这表明间隙连接通道要么没有正确组装，要么不允许分子信号通过。无论哪种方式，这些突变都会减少细胞间通讯。
其他 ODDD 突变阻止连接蛋白到达细胞膜。携带这些突变的患者通常患有更严重的疾病，包括皮肤病以及其他缺陷。这一发现表明，连接蛋白半通道可能除了在构建间隙连接中发挥作用外，还有其他工作，并且当这项工作未完成时——就像连接蛋白从未到达细胞膜时发生的那样——会出现更严重的问题。例如，也许一些半通道没有配对形成通道，而是保持未耦合状态，从而允许细胞释放信号或从其环境中吸收分子。这些分子可能与通常通过间隙连接通道的分子不同。这种半通道活性已通过实验得到证明，为我们理解连接蛋白在细胞通讯中所起的作用增加了一个新的维度。对突变型半通道的进一步研究可能会揭示新的靶点——包括尚未确定的通过未耦合半通道的分子——用于治疗 ODDD 或其他基于连接蛋白的疾病。
讲述秘密
研究突变如何影响间隙连接的构建和行为也可能导致高度靶向的疗法，这些疗法可以抵消突变的影响，而不会引发严重的、不必要的副作用。例如，了解特定的突变会改变间隙连接的组装——但不会改变连接蛋白向细胞表面的运输——可能会为一种药物指明方向，该药物可能会恢复连接蛋白形成功能性通道的能力。这种靶向疗法可以提供一种重建细胞间通讯的方法，而无需完全替换突变型连接蛋白——这个过程将涉及基因疗法，这仍然是一种有风险且实验性的方法。
在连接蛋白中发现致病突变不仅提供了有希望的治疗靶点。它还为研究人员提供了一套新颖的工具来研究间隙连接的基本生物学。例如，我们仍然不完全了解通过间隙连接在细胞之间传递的特定分子。在心脏细胞的情况下，我们知道通过间隙连接流动的离子在细胞之间传递电信号。但是，我们几乎不知道在细胞之间传递什么以支持例如耳朵中的听觉器官的功能或皮肤中的伤口愈合反应。通过观察连接蛋白通道在不同细胞中的行为方式，以及它们组装和活动的变化如何引发疾病，我们最终将能够解决关于这种亲密的细胞通讯形式的最基本问题：细胞之间究竟在窃窃私语什么，这些分子秘密如何支配复杂生物体（包括我们自己）的组装和运作？