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（编者注：本文最初发表于《大众科学》杂志2005年1月刊。我们发布这篇文章是因为与猪流感相关的最新消息。）
1918年9月7日，正值第一次世界大战高峰期，波士顿郊外一个陆军训练营的一名士兵因发高烧来到医务室。医生诊断他患有脑膜炎，但在第二天，当十几名士兵因呼吸道症状住院时，他们改变了主意。16日又出现了36例这种不明疾病的新病例。令人难以置信的是，到9月23日，在这个45,000名士兵的营地中，已报告了12,604例病例。到疫情结束时，该营地三分之一的人口将患上这种严重疾病，其中近800人将死亡。死去的士兵常常出现蓝色的皮肤颜色，并在窒息死亡前可怕地挣扎。许多人在症状出现后不到48小时就死亡了，尸检时发现他们的肺部充满了液体或血液。
由于这一系列不寻常的症状与任何已知的疾病都不符，当时著名的病理学家威廉·亨利·韦尔奇推测“这一定是某种新型感染或瘟疫”。然而，这种疾病既不是瘟疫，甚至也不是新的。它只是流感。尽管如此，这种特别具有毒性和传染性的流感病毒株据信在1918年至1919年间在全球范围内造成多达4000万人死亡。
这场现代历史上最致命的流感爆发几乎像它出现时一样迅速消失，其病因长期以来被认为已淹没在时间的长河中。没有人保存病原体的样本以供日后研究，因为直到20世纪30年代，流感才被确定为病毒。但由于美国陆军医学博物馆令人难以置信的远见卓识、一位名叫约翰·胡尔丁的病理学家的坚持，以及对旧组织样本进行基因分析的进展，我们已经能够检索到1918年病毒的部分片段并研究其特征。现在，在1918-1919年可怕的自然灾害发生80多年后，从少数受害者身上回收的组织正在解答关于这种大流行毒株的性质以及关于流感病毒的一般运作方式的基本问题。
这项努力不仅仅是出于历史好奇心。由于流感病毒不断进化，新的流感毒株不断威胁着人类 population。自1918年以来，大流行性人类流感病毒已经出现过两次——分别在1957年和1968年。通常只感染动物的流感毒株也 периодически 在人类中引起疾病，正如最近在亚洲爆发的禽流感所见。我们的两个主要目标是确定是什么使1918年的流感如此致命，以指导流感治疗和预防措施的开发，并确定大流行病毒的起源，以更好地锁定未来大流行毒株的可能来源。
追寻1918年病毒
在许多方面，1918年的流感大流行与之前和之后的其他流感大流行相似。每当一种新的流感毒株出现，其特征是大多数人的免疫系统从未遇到过的，就可能发生广泛的流感爆发。但1918年大流行的某些独特特征长期以来仍然令人费解。
例如，它的广度和深度都非常突出。疫情席卷欧洲和北美，远至阿拉斯加荒野和太平洋最偏远的岛屿。最终，世界人口的三分之一可能受到感染。这种疾病也非常严重，死亡率为2.5%至5%——高达其他流感爆发死亡率的50倍。
到1918年秋季，欧洲每个人都称这种疾病为“西班牙”流感，可能是因为中立的西班牙没有像交战国那样对疫情新闻实施战时审查。这个名字流传了下来，尽管大流行的第一次爆发，或称春季浪潮，似乎在1918年3月在美国的军营及其周围地区出现。全球大流行的第二次主要浪潮发生在1918年9月至11月，在许多地方，1919年初又一次严重的流感浪潮来袭。
抗生素尚未被发现，大流行期间死亡的大多数人死于机会性细菌引起的肺炎，这些细菌感染了那些已经因流感而虚弱的人。但一部分流感受害者在症状出现后几天就死于更严重的病毒性肺炎——由流感本身引起——这导致他们的肺部大量出血或充满液体。此外，大多数死亡发生在15至35岁的年轻人中，这个群体很少死于流感。引人注目的是，在1918-1919年，65岁以下的人占所有“超额”流感死亡人数（高于正常年平均水平）的99%以上。
了解1918年大流行的原因及其不寻常特征的努力几乎在疫情结束后立即开始，但罪魁祸首病毒本身仍然隐藏了近八十年。1951年，来自爱荷华大学的科学家，包括一位最近从瑞典来的名叫约翰·胡尔丁的研究生，远赴阿拉斯加的苏厄德半岛寻找1918年的毒株。1918年11月，流感在五天内蔓延到一个现在被称为布雷维格米申的因纽特人渔村，造成72人死亡——约占成年人口的85%。他们的尸体此后一直埋在永久冻土中，1951年探险队的成员希望在受害者的肺部找到保存下来的1918年病毒。不幸的是，所有从这些标本中培养活流感病毒的尝试都失败了。
1995年，我们小组开始尝试使用不同的组织来源寻找1918年的病毒：在武装部队病理研究所 (AFIP) 存档的尸检标本。几年来，我们一直在开发从受损或腐烂的组织中提取脆弱的病毒遗传物质以用于诊断目的的专业知识。例如，1994年，我们能够利用我们的新技术帮助一位AFIP海洋哺乳动物病理学家调查一起被归咎于赤潮的大规模海豚死亡事件。尽管可用的海豚组织样本严重腐烂，但我们从其中提取了足够的RNA片段，以鉴定出一种新的病毒，类似于引起犬瘟热的病毒，这被证明是海豚死亡的真正原因。很快，我们开始想知道，我们研究所的资源是否可以解决任何更古老的医学谜团。
AFIP是1862年成立的美国陆军医学博物馆的后裔，随着病理学医学专业的成长而发展，现在收藏了三百万个标本。当我们意识到这些标本包括1918年流感受害者的尸检样本时，我们决定追踪这种大流行病毒。我们的初步研究检查了1918年秋季致命浪潮中78名受害者的组织样本，重点关注那些具有严重肺损伤特征的快速死亡患者。由于流感病毒通常在感染后几天内清除肺部，我们有最大的机会在这些受害者身上找到病毒残余。
当时的 стандартная практика 是将尸检标本保存在甲醛中，然后将其包埋在石蜡中，因此从这些80年前的“固定”组织中分离出微小的病毒遗传片段，将我们开发的技术推向了极限。经过令人痛苦的一年无果而终，我们在1996年找到了第一个流感阳性样本，这是一个1918年9月在南卡罗来纳州杰克逊堡去世的士兵的肺部标本。我们能够确定来自该样本的五个流感基因的小片段中的核苷酸序列。
但是为了确认这些序列属于致命的1918年病毒，我们继续寻找更多的阳性病例，并在1997年又发现了一例。这位士兵也于1918年9月在纽约州厄普顿营去世。拥有第二个样本使我们能够确认我们已有的基因序列，但是从这些尸检中剩余的少量组织使我们担心，我们永远无法生成完整的病毒序列。
1997年，一个意想不到的来源为我们的问题提供了解决方案：约翰·胡尔丁，当时是一位73岁的退休病理学家，他读到了我们的初步结果。他主动提出返回布雷维格米申，再次尝试挖掘埋在永久冻土中的1918年流感受害者。在他第一次尝试46年后，在布雷维格米申委员会的许可下，他获得了四名流感受害者的冷冻肺活检样本。在其中一个样本中，来自一位年龄不明的女性，我们发现了流感RNA，这为1918年病毒的整个基因组测序提供了关键。
最近，我们的小组与英国同事合作，也一直在调查来自伦敦皇家医院的1918年流感受害者的尸检组织样本。我们已经能够分析来自其中两例病例的流感病毒基因，并发现它们与北美样本几乎相同，证实了一种统一病毒在全球范围内的快速传播。但是，这些序列能告诉我们关于1918年毒株的毒力和起源的什么信息呢？回答这些问题需要一些关于流感病毒如何发挥作用并在不同宿主体内引起疾病的背景知识。
流感多变的面孔
过去100年中引起大流行的三种新型流感毒株都属于A型流感病毒组。流感主要有三种形式，分别标记为A、B和C。后两种仅感染人类，从未引起大流行。另一方面，A型流感病毒已被发现感染多种动物，包括家禽、猪、马、人类和其他哺乳动物。水禽，如鸭子，是所有已知亚型A型流感的天然“宿主”，这意味着该病毒感染鸟类的肠道而不会引起症状。但是，这些野生禽类毒株会随着时间的推移发生变异，或与其他流感毒株交换遗传物质，从而产生能够在哺乳动物和家禽中传播的新型病毒。
A型流感病毒的生命周期和基因组结构使其易于进化和交换基因。该病毒的遗传物质由八个独立的RNA片段组成，这些片段包裹在镶有蛋白质的脂质膜中。为了繁殖，病毒结合并进入活细胞，在那里它征用细胞机制，诱导其制造新的病毒蛋白和病毒RNA的额外拷贝。然后，这些片段自行组装成新的病毒，这些病毒逃离宿主细胞，继续感染其他细胞。没有校对机制确保RNA拷贝的准确性，因此导致新突变的错误很常见。更重要的是，如果两种不同的流感病毒毒株感染同一个细胞，它们的RNA片段可以在那里自由混合，产生后代病毒，其中包含来自两种原始病毒的基因组合。病毒基因的这种“重配”是产生多样化新毒株的重要机制。
不同的循环A型流感病毒通过参考其表面的两种标志性蛋白质来识别。一种是血凝素 (HA)，它至少有15种已知的变体或亚型。另一种是神经氨酸酶 (NA)，它有九个亚型。暴露于这些蛋白质会在宿主体内产生独特的抗体，因此1918年毒株是第一个被命名为“H1N1”的毒株，这是基于在大流行幸存者的血液中发现的抗体。事实上，毒性较低的H1N1后代一直是主要的循环流感毒株，直到1957年，H2N2病毒出现，引起了一场大流行。自1968年以来，H3N2亚型（引发了当年的大流行）占据了主导地位。
给定A型流感病毒上存在的HA和NA蛋白质亚型不仅仅是标识符；它们对于病毒繁殖至关重要，并且是受感染宿主免疫系统的主要目标。HA分子通过与某些宿主细胞表面的受体结合来启动感染。这些受体往往是哺乳动物的呼吸道内壁细胞和鸟类的肠道内壁细胞。NA蛋白使新的病毒拷贝能够逃离宿主细胞，以便它们可以继续感染其他细胞。
宿主首次接触HA亚型后，抗体将在未来阻止受体结合，因此非常有效地防止再次感染同一毒株。然而，对人类来说是新的HA亚型的流感病毒 периодически 出现，最有可能通过与感染野生鸟类的广泛流感病毒库重配。通常，适应于禽类宿主的流感HA与人类呼吸道中普遍存在的细胞表面受体的结合不良，因此禽类病毒的HA结合亲和力必须经过一定程度的修改，病毒才能在人类中有效复制和传播。直到最近，现有的证据表明，完全的禽流感病毒可能无法直接感染人类，但在1997年香港有18人感染了禽类H5N1流感病毒，其中6人死亡。
一种更具致病性的H5N1毒株的爆发在2003年和2004年在亚洲家禽中变得普遍，在越南和泰国，超过30人感染了这种病毒并已死亡。流感病毒一旦感染宿主，其毒力取决于一系列复杂的因素，包括病毒进入不同组织的容易程度、其复制速度以及宿主对入侵者的免疫反应的强度。因此，准确了解是什么使1918年大流行流感毒株如此具有传染性和毒力，可以为了解是什么使任何流感毒株更具威胁性或威胁性较小提供重要的见解。
致命杀手的面孔
通过我们检索到的1918年RNA，我们已经使用病毒自身的基因作为配方来制造其组成部分——本质上是重建致命病毒自身的部分片段。我们渴望检查的第一个部分是血凝素蛋白，以寻找可能解释1918年毒株异常毒力的特征。
例如，我们可以看到，1918年HA中与宿主细胞结合的部分与完全禽流感HA的结合位点几乎相同。在1918年的两个分离株中，该受体结合位点与禽类形式仅相差一个氨基酸构建块。在其他三个分离株中，第二个氨基酸也发生了改变。这些看似细微的突变可能代表了允许禽类HA与哺乳动物类受体结合所需的最小变化。
但是，虽然获得新的结合亲和力是病毒感染一种新型宿主的关键步骤，但这并不一定能解释为什么1918年毒株如此致命。我们转向基因序列本身，寻找可能与毒力直接相关的特征，包括其他流感病毒中的两个已知突变。其中一个涉及HA基因：为了在细胞中变得活跃，HA蛋白必须被宿主提供的肠道特异性蛋白切割酶或蛋白酶切割成两部分。一些禽类H5和H7亚型病毒获得了一种基因突变，该突变在切割位点添加了一个或多个碱性氨基酸，从而允许HA被普遍存在的蛋白酶激活。在鸡和其他鸟类中，感染这种病毒会导致多个器官甚至中枢神经系统疾病，死亡率非常高。目前在亚洲传播的H5N1病毒中已观察到这种突变。然而，我们在1918年的病毒中没有发现它。
另一个对毒力有显着影响的突变已在感染小鼠的两种流感病毒毒株的NA基因中观察到。同样，单个氨基酸的突变似乎允许病毒在许多不同的身体组织中复制，并且这些流感毒株通常对实验室小鼠是致命的。但我们在1918年病毒的NA中也没有看到这种突变。由于对1918年病毒基因的分析没有揭示任何可以解释其极端毒力的特征，我们与其他几个机构发起了一项合作努力，以重建1918年病毒本身的部分片段，以便我们可以观察它们在活组织中的作用。
一种称为基于质粒的反向遗传学的新技术使我们能够复制1918年的病毒基因，然后将它们与现有流感毒株的基因结合起来，从而产生一种杂交病毒。因此，例如，我们可以采用一种适应小鼠的流感毒株，并为其提供不同组合的1918年病毒基因。然后，通过用这种工程病毒感染活体动物或人体组织培养物，我们可以看到大流行毒株的哪些成分可能是其致病性的关键。
例如，1918年病毒产生对上下呼吸道组织快速而广泛损害的独特能力表明，它复制到大量并从细胞到细胞迅速传播。已知病毒蛋白NS1可阻止I型干扰素 (IFN) 的产生——I型干扰素是细胞用于启动针对病毒感染的免疫反应的“早期预警”系统。当我们在人体肺细胞的组织培养物中测试重组病毒时，我们发现具有1918年NS1基因的病毒确实更有效地阻断了宿主的I型IFN系统。
迄今为止，我们已经产生了含有1918年基因中一到五个的重组流感病毒。有趣的是，我们发现任何拥有1918年HA和NA基因的重组病毒都对小鼠是致命的，引起了类似于一些大流行死亡病例中看到的严重肺损伤。当我们分析这些肺组织时，我们发现了参与常见炎症反应的基因激活的特征。但我们也发现了高于正常水平的与免疫系统的攻击士兵、T细胞和巨噬细胞相关的基因激活，以及与组织损伤、氧化损伤和细胞凋亡或细胞自杀相关的基因激活。
最近，威斯康星大学麦迪逊分校的川冈义裕报告了在小鼠中使用1918年流感基因进行的类似实验，结果相似。但是，当他分别测试HA和NA基因时，他发现只有1918年HA产生了强烈的免疫反应，这表明，由于一些尚不清楚的原因，这种蛋白质可能在1918年毒株的毒力中发挥了关键作用。
这些正在进行的实验正在为过去打开一扇窗户，帮助科学家了解1918年大流行的不寻常特征。同样，这些技术将用于研究当前H5N1禽流感毒株的哪些类型的变化可能使这种极具致命性的病毒有可能在人类中引起大流行。一个同样引人入胜的问题是，如此高毒力的毒株最初是如何出现的，因此我们的小组也一直在分析1918年病毒的基因，以寻找关于其可能起源的线索。
寻找来源
分析流感病毒之间关系的最佳方法是系统发育学，即使用病毒基因序列和关于基因典型突变频率的知识构建假设的家族树。由于流感病毒的基因组由八个可以通过重配独立移动的离散RNA片段组成，因此必须对每个基因片段分别进行这些进化研究。
我们已经完成了对1918年病毒八个RNA片段中的五个片段的分析，到目前为止，我们将1918年流感基因与众多人类、猪和禽流感病毒的基因进行比较，总是将1918年病毒置于人类和猪科系中，而不是禽类病毒组之外。然而，1918年病毒基因确实具有一些禽类特征，因此病毒最初可能在1918年之前的某个时候从禽类宿主中出现。但显然到1918年，该病毒已经获得了足够的哺乳动物适应性，可以作为人类大流行病毒发挥作用。问题是，在哪里？
当我们分析1918年血凝素基因时，我们发现该序列与禽类序列的差异比1957年H2和1968年H3亚型更多。因此，我们得出结论，要么1918年HA基因在中间宿主体内花费了一段时间，在那里它从原始禽类序列中积累了许多变化，要么该基因直接来自禽类病毒，但该病毒与已知的禽类H1序列明显不同。
为了调查禽类H1基因可能在1918年大流行后的八十年里发生了重大变化的后一种可能性，我们与史密森学会国家自然历史博物馆和俄亥俄州立大学的科学家合作。在检查了那个时代的许多保存下来的鸟类后，我们的小组从1917年收集并在史密森学会鸟类收藏中用乙醇保存的一只黑雁中分离出了一种禽类亚型H1流感毒株。事实证明，1917年的禽类H1序列与现代北美禽类H1毒株密切相关，这表明禽类H1序列在过去80年中变化不大。对更多野生鸟类H1毒株进行广泛测序可能仍会鉴定出一种更类似于1918年HA的毒株，但可能找不到类似于1918年毒株的禽类H1，因为事实上，HA并没有直接从鸟类毒株重配而来。
在那种情况下，它一定有一些中间宿主。猪是一个被广泛提出的可能性，因为众所周知，猪对人类和禽类病毒都易感。事实上，在1918年大流行期间，人类和猪都出现了同步的流感爆发，但我们认为传播方向最有可能从人类到猪。自1918年以来，有许多人类A型流感病毒毒株感染猪的例子，但猪流感毒株仅 периодически 从人类中分离出来。尽管如此，为了探索1918年HA可能最初是一种禽类形式，逐渐适应猪等哺乳动物宿主的可能性，我们研究了禽类病毒在猪体内进化的当前例子——一种禽类H1N1流感谱系，该谱系在过去25年中已在欧洲猪体内建立。我们发现，即使在猪体内进化了20年，也没有导致1918年大流行毒株所表现出的与禽类序列的差异数量。
当我们将这些类型的分析应用于其他四个1918年病毒基因时，我们得出了相同的结论：引发1918年大流行的病毒很可能是一种禽类毒株，它在进化上与典型的野生水禽流感基因库隔离了一段时间——一种像SARS冠状病毒一样，从一个尚未知晓的动物宿主进入人类循环的病毒。
未来的研究
我们对1918年病毒的五个RNA片段的分析为了解其起源提供了一些线索，并强烈表明，大流行病毒是随后的所有人和猪H1N1谱系的共同祖先，而不是从猪中出现的。迄今为止，对病毒基因的分析尚未提供关于1918年病毒毒株异常毒力的明确线索。但是，使用含有1918年基因的工程病毒进行的实验表明，某些1918年病毒蛋白可能促进病毒的快速复制并引发强烈的破坏性宿主免疫反应。
在未来的工作中，我们希望可以将1918年大流行病毒毒株置于紧随其前后的流感病毒的背景下进行研究。大流行病毒的直接前体，即第一次或春季浪潮病毒毒株，缺乏秋季浪潮的异常毒力，并且似乎传播性较差。目前，我们正在寻找来自春季浪潮受害者的流感RNA样本，以鉴定两种毒株之间的任何基因差异，这可能有助于阐明为什么秋季浪潮更为严重。同样，找到1918年之前的人类流感RNA样本将阐明1918年病毒中的哪些基因片段对人类来说是完全新的。如果该病毒与早期传播的毒株具有共同特征，而老年人对这些毒株具有一定的免疫力，则可能解释1918年大流行期间年轻人异常高的死亡率。并且找到1920年代及以后的H1N1样本将有助于我们了解1918年病毒随后演变成毒力较低形式的过程。
我们必须记住，大流行流感毒株起源的机制尚未完全了解。由于1957年和1968年的大流行毒株具有禽类样HA蛋白，因此最有可能的是它们起源于禽类和人类病毒毒株的直接重配。然而，这些重配事件的实际情况从未被确定，因此没有人知道新型毒株发展成人类大流行需要多长时间。
1918年大流行毒株更加令人费解，因为其基因序列既不符合直接从已知禽类毒株重配，也不符合禽类毒株在猪体内的适应性。如果事实证明1918年病毒通过与随后的的大流行毒株不同的机制获得了新的基因，这可能会对公共健康产生重要影响。另一种起源甚至可能促成了1918年毒株的异常毒力。对更多禽流感病毒进行测序以及研究猪以外的其他中间宿主，如家禽、野生鸟类或马，可能会为1918年大流行的来源提供更多线索。在更好地了解此类毒株的起源之前，检测和预防工作可能会忽略下一次大流行的开始。