雌性小鼠能改善自闭症研究吗？

在加利福尼亚州萨克拉门托的一个实验室里，一排排装有玉米芯垫料的塑料箱里养着大约 800 只小鼠。即使在这个干净明亮的房间里，这么多小鼠集中在一个地方的气味仍然令人难以忍受——刺鼻，并且任何养过仓鼠或沙鼠宠物的人都熟悉。大多数箱子里都装着四只成年小鼠，它们四处窜动，鼻子抽搐，盯着正在观看它们的人类。但在其中一个箱子里，一只光滑的白色小鼠正蜷缩在一个角落里，哺乳着她那半打左右扭动的、毛色较深的幼崽。

在大多数研究实验室中，这些幼崽的命运将由它们的性别决定。雄性将一生作为实验对象。雌性要么被保留用于繁殖，要么仅仅因为它们不适合实验而被安乐死：据称，雌性比雄性更难操作，产生的数据一致性更差，而且维持雌雄两种性别需要花费太多，它们必须分开饲养。或者，至少这是之前的理由。

但这些小雌性幼崽有所不同。它们所在的实验室由加州大学戴维斯分校 (UC Davis) MIND 研究所的研究员 吉尔·西尔弗曼 和 杨慕 运营。这两位科学家研究了大约 15 种自闭症小鼠模型的行为，并且他们的工作中始终包括雌性和雄性。

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当幼崽长大后，它们将学会划桨穿过水迷宫或在它们的垫料中埋下黑色弹珠，让研究人员深入了解它们的记忆和行为与典型小鼠的比较。寻找自闭症的最佳动物行为模型至关重要，因为行为是这种疾病的核心。在人类中，自闭症是根据行为标准诊断的：异常的社交互动、沟通困难和重复性动作。

理想情况下，这些小鼠应该尽可能像它们的人类 counterparts。当然，一只微小的、夜间活动的啮齿动物能像一个聪明、双足行走的灵长类动物有多大的限度。但是，如果一只小鼠与人不一样，那么一只雄性小鼠就更不像女性了，尤其是在定义自闭症的事情上。男孩的诊断通常是女孩的四倍，并且自闭症的表现因性别而异；在女孩中，这种疾病通常更加微妙且更难检测。

“女孩患有自闭症。也许在统计数据中不像男孩那样突出，但女孩确实患有自闭症，并且有重要的研究表明，患有自闭症的女孩与男孩的类型非常不同，”西尔弗曼说。“所以我认为女性的研究同样重要。”

西尔弗曼和杨的研究不仅包括两种性别的小鼠，而且还分别分析它们的行为。长期以来，这种方法不是必需的，但现在其他人必须赶上他们的步伐。一年前，美国国立卫生研究院 (NIH) 推出了新的指令的第一阶段，该指令要求通过 NIH 拨款资助的研究人员要么包括他们将如何使用两种性别动物的计划，要么解释为什么他们只使用一种性别。希望通过研究雌性和雄性，科学家们将更好地了解从行为到大脑解剖结构到药物代谢的性别差异。

新规定给整个领域提出了有趣的问题：由于自闭症在男孩中更常见，研究人员是否应该将适量的资源用于研究雄性小鼠？研究人员是否应该专注于与主要影响女孩的瑞特综合征相关的研究中的女性？如果科学家开始在每个实验中都包括两种性别，谁来支付额外小鼠的费用？

为了适应这种新现实，科学家们需要更深入地思考性别何时重要，何时不重要。在 NIH 指令生效的这一年中，它迄今为止仅改变了研究人员编写拨款和计划研究的方式。“我想说，在几年内，应该有可能开始看到出版物的差异，”马萨诸塞州北安普顿史密斯学院的神经科学家 安娜丽丝·贝里 说，她自 2009 年以来一直呼吁研究人员解决性别差异，她的工作是导致 NIH 指令的更大运动的一部分。
 
这些研究的结果可能会以意想不到的方式推动自闭症研究向前发展。如果自闭症主要影响男性，那么了解性别之间的差异可以解释原因，反过来，这可能会揭示有关该疾病的根本原因的一些信息。

借口，借口
历史上，女性通常被排除在临床研究之外，因为性别不被认为是健康或疾病的主要因素。即使怀疑性别是因素，研究人员也认为女性由于每月一次的激素周期而难以研究。他们还担心实验治疗可能会伤害孕妇或她们的婴儿，尤其是在 20 世纪 60 年代，当时发现晨吐药物沙利度胺会导致出生缺陷。“具有生育能力的女性应排除在最早的剂量范围研究之外，”美国食品药品监督管理局 (FDA) 在 1977 年的一份报告中声称。

医学研究所 2012 年的一份报告指出，该指南对临床研究的所有阶段都产生了令人沮丧的影响：生物医学研究人员害怕在他们的研究中纳入女性。女性参与的少量研究侧重于生殖。对于其余大部分，研究人员将从男性收集的数据推广到女性，尽管在生理、激素和神经学方面存在根本差异。

“根本的假设是，如果你研究男性，那就足够了，你可以从那里推断到其他人，”贝里说。“我们已经看到很多例子表明，这种假设显然不成立，那里存在真正重要的生物性别差异。”

例如，女性比男性更常患有焦虑和抑郁症，她们也更容易患上中风和甲状腺疾病。女性代谢药物的方式也不同，而且更容易出现副作用。

其中最臭名昭著的例子是失眠药物唑吡坦，以安必恩的名义销售，该药物于 1992 年获得 FDA 批准。许多女性代谢这种药物的速度非常慢，以至于在服药后的第二天早上，这种药物仍然存在于血液中，导致她们无法开车或进行其他需要精神敏锐的任务。在唑吡坦推出十多年后，FDA 才正式解决这个问题；在 2013 年，它将女性的推荐剂量减半。

妇女健康运动——20 世纪 60 年代兴起的一股政治力量，最初关注生殖权利——反对仅限男性研究的结果同样适用于女性的假设。活动家要求改善所有女性的医疗保健，并结束医疗系统中的性别歧视。NIH 于 1986 年以一份报告正式回应，承认女性的健康问题超出繁殖范围，并建议将两种性别都纳入研究。1993 年，新规定要求 NIH 资助的研究人员在临床试验中纳入更多女性。

今天，超过一半的 NIH 资助的临床试验参与者是女性。但在临床前研究（使用动物和细胞的工作）中，对男性的偏爱仍然坚定不移。在 2011 年的一项荟萃分析中，贝里和加州大学伯克利分校的心理学教授 欧文·祖克 深入研究了生物学的 10 个领域，例如生物学和药理学，以了解动物研究中的性别偏见有多严重。

他们发现情况相当糟糕：10 个学科中有 8 个学科表现出强烈偏爱男性。他们的研究不够细致，无法分析自闭症研究，但它发现的最突出的差异是在神经科学领域，其中仅使用男性的研究数量超过仅使用女性的研究数量五倍以上。“这甚至没有计算他们在方法中没有声明性别的研究，这些研究可能通常只是男性，”贝里说。

这种不平衡的方法可能意味着一些研究误解了动物的实际行为方式。像男性和女性一样，雄性和雌性啮齿动物具有独特的基于性别的特征。在小鼠中，根据品系的不同，两性可能表现出不同程度的焦虑，这可以通过动物探索新物体或空间的意愿来检测。女性具有母性本能，而男性则可能具有攻击性和领地性。

多伦多大学医学生物物理学教授 杰森·勒奇 说，大脑也存在差异。例如，纹状体终末床核和杏仁核的部分区域（在大脑中起社交行为作用的结构）在雄性小鼠中通常比在雌性小鼠中更大。雄性和雌性也具有不同水平的性激素，这会影响大脑的发育和功能。

排除雌性动物的原因是熟悉的：雌性在动情周期期间的定期激素波动会使其行为和生理更难以预测，并且这种自然的可变性会使相关测试的数据不可靠。

这些事情可能是真的，但可以解释清楚，勒奇说。“我们明确地观察了动情周期如何影响整个周期不同阶段的大脑，”他说。“它确实有影响，尤其是在海马体中，但它非常微妙。”

来自芝加哥大学和加州大学伯克利分校的 2014 年的一项研究进一步证明了这一点。研究人员分析了 293 篇科学文章，这些文章研究了处于后者的动情周期的不同阶段的雄性和雌性小鼠的一系列特征。他们发现，雌性不仅不比雄性更具可变性，而且雄性在某些条件下实际上更具可变性。该报告的标题宣称：“雌性小鼠获释，可以纳入神经科学和生物医学研究。”

榜样行为
到目前为止，只有少数自闭症研究中动物的性别似乎有所不同，但这可能是因为科学家们才刚刚开始观察。

一些最常用的自闭症小鼠模型是基因敲除小鼠，这些小鼠经过工程改造，使得某些基因缺失或关闭。这些基因修饰技术在 20 世纪 80 年代首次亮相，但第一个自闭症基因敲除小鼠的开发花费了更长的时间，直到 21 世纪初才出现。

迄今为止，研究人员已经创建了676个小鼠模型，这些模型据称捕捉到了该疾病的某些特征。杨指出，没有一个模型能够完全代表自闭症。“打个比方：爱乐乐团中的任何乐器都不能单独发出交响乐的声音。”

任何科学家都会很快指出，即使是最好的模型小鼠实际上也没有患上自闭症，自闭症是一种独特的人类疾病。但由于小鼠天生具有社交性和沟通能力，而且它们的正常活动（例如梳理毛发或玩耍的频率）是众所周知的，因此那些偏离常态的小鼠很容易进行研究。即使是近似的模型也可能非常有价值，能够识别出疾病的生物学机制或有助于治疗的药物。

在加州大学戴维斯分校等实验室中，研究人员会测试突变小鼠的行为，这些行为可能类似于自闭症的症状。

一个例子是奶昔记忆测试。在距离小鼠实验室几层楼上的办公桌旁，西尔弗曼在她的电脑屏幕上打开了一个视频。这是一个黑白的俯瞰视图，一只灰色的小鼠坐在一个三角形的围栏中，就像一个来自迷你便利店监控摄像头的监控录像。小鼠前面有两个触摸屏，闪烁着简单的图像——左边是一架飞机，右边是一只蜘蛛。小鼠用鼻子推了一下蜘蛛，然后迅速跑到围栏的后方，那里有一个活板门打开，露出一小口草莓奶昔。

西尔弗曼说，在小鼠学会哪个图像会带来奖励之后，研究人员可以更改规则，也许让飞机带来甜美的零食。正常的小鼠可以重新学习图像的顺序，但自闭症模型通常更不愿偏离原来的路径——这让人想起自闭症患者的刻板行为。其他行为测试会检查社交性，让小鼠选择与其他小鼠或无生命物体相处的时间；冒险性，小鼠可以冒险走到高高的开放式边缘或躲在黑暗的封闭空间中；以及重复行为，重点是过度梳理毛发或跳跃。

西尔弗曼调出了她团队最近实验的一组原始数据：条形图比较了六种不同品系的小鼠在旨在检测与自闭症相关的行为的各种测试中的性别差异。在这个有限的数据集中，性别之间没有显著差异。但西尔弗曼说，这并不意味着性别差异不存在。

“有些测试更敏感，更复杂，可能能够发现它，”杨补充说，他正从西尔弗曼的肩膀上探头看。例如，这些差异可能会在更复杂的行为分析和药物测试中显现出来，西尔弗曼和杨正在探索这些测试。

在其他实验室中，已经开始出现雄性和雌性小鼠受试者之间一些有趣的差异。一个例子来自北卡罗来纳大学卡罗莱纳发育障碍研究所精神病学教授兼小鼠行为表型核心主任谢丽尔·莫伊的实验室。莫伊的工作重点是激素催产素，它可以作为药物给予自闭症模型小鼠，并可能鼓励它们更具社交性。她的研究小组在2013年表明，来自一种名为 C58/J 品系（具有重复行为和低社交性）的雄性和雌性小鼠对催产素的反应不同。在雌性中，亲社会效应发生得更快，持续时间更长。“这些结果表明，催产素可能对雌性特别有效——如果我们只看雄性小鼠，我们就不会观察到这一点，”莫伊说，她现在正在比较其他自闭症模型中不同性别的催产素反应。

大脑成像研究（科学家扫描微小的小鼠大脑以了解自闭症模型中的神经解剖学差异）也揭示了基于性别的模式。2014 年，勒奇的研究小组使用磁共振成像来比较 26 种不同的自闭症小鼠模型的大脑，以查看它们是否具有常见的异常。研究人员发现，雄性和雌性小鼠之间差异最显着的大脑区域，例如终纹床核和杏仁核，也是 26 种小鼠模型中许多存在异常的区域。勒奇说，这强烈暗示了性别差异可能很重要，尽管性别所起的具体作用尚不清楚。“这些是我们还不了解的事情，”他说。“但我认为我们需要了解它们才能了解自闭症。”
 
在瑞特综合征的临床前研究中，性别问题尤其突出，瑞特综合征是由 X 染色体上的一个基因突变引起的。携带突变基因的男孩会早逝，而女孩则会存活下来，但会伴有发育问题，其中包括自闭症的特征和随着年龄增长通常会逐渐恶化的运动问题。同样，缅因州巴港杰克逊实验室的副教授张中伟说，携带瑞特突变的雄性小鼠的症状比雌性严重得多。由于这些严重症状发展迅速且易于检测，许多研究人员更喜欢只使用雄性小鼠。

德克萨斯州休斯顿贝勒医学院的神经生物学和遗传学教授胡达·佐比说，这种偏见可能意味着研究人员遗漏了有关该综合征的宝贵信息。由于突变需要更长的时间才能影响雌性小鼠，研究人员有机会研究它如何在整个生命周期中改变行为和大脑功能。“研究雌性真的很有价值，因为她们的症状发作进展缓慢，”佐比说，“这与我们在人类患者中看到的情况相同。”

软性资金
萨克拉门托实验室的这只小白鼠妈妈和她的邻居们享受着格外舒适的住所。它们呼吸的空气每小时循环 15 次，只喝纯净水。当动物们进行测试时，研究人员和实验室技术人员会低声细语，以免打扰它们。

这种奢华是有代价的。一个笼子每天的维护费用约为 1.10 美元，该笼子可容纳四只小鼠。杨和西尔弗曼表示，一项典型的行为测试旨在每组使用 20 只小鼠，以获得足够的统计功效。大多数测试需要三组：对照组、携带一个目标基因拷贝的基因改造小鼠以及携带两个该基因拷贝的基因改造小鼠。这使得每次测试需要 60 只小鼠。与其他研究领域相比，此类测试需要更多的动物，部分原因是行为实验中已经存在许多可能导致统计噪声的变量——从房间的温度到处理人员是否使用了新的古龙水。

根据美国国立卫生研究院的新规定，为了获得每个性别的相同数据量，这个最小值可能会翻倍，因为这两个数据集通常会单独报告（除非没有明显的差异，在这种情况下，研究人员可能会合并数据集以提高统计功效）。笼子的费用将翻倍，不仅因为动物数量将增加一倍，还因为雄性和雌性必须分开，以免它们交配。考虑到行为测试可能需要长达两个月的时间，而且小鼠通常在实验室中生活四到五个月，因此该规定的成本会迅速增加。

目前尚不清楚研究人员将在哪里找到额外的资金——美国国立卫生研究院尚未承诺为试图满足这一要求的人员增加拨款。“我认为我们现在这样做很棒，但这对资金有什么影响？”在杰克逊实验室讲授小鼠行为特征课程的斯泰西·里佐问道。“我的同事们在申请拨款时，并没有看到奖励金额的增加来弥补[新规定]。”

为了回应这些担忧，杰克逊实验室的科学家加里·丘吉尔通过统计模型运行了假设的设计场景，以计算出一般研究人员可能需要多少只小鼠。这些计算包括有关测试类型、预期效果以及反应的可变性的信息。

他发现，根据研究类型，一些研究人员可能需要两倍的动物。其他研究人员可能只需要在他们的实验中增加一些。他说：“答案取决于基本的未知数，即：性别在哪些方面存在差异？”

美国国立卫生研究院妇女健康研究办公室主任珍妮·克莱顿同意研究小鼠的数量不一定需要翻倍。她说，美国国立卫生研究院将评估拨款，不仅要看它们是否包括两种性别，还要看它们如何考虑性别影响他们的研究问题和设计的方式。“从长远来看，当科学家在基础科学和转化科学的早期研究两种性别时，可以节省资金，”她说。

竞争激烈
在萨克拉门托以西约 20 英里的地方，西尔弗曼走进了一个几乎与她小组的小鼠实验室相同的实验室，有两个明显的不同之处：一切都更大，而且实验室里养的不是小鼠，而是大鼠。

从历史上看，小鼠一直是自闭症研究的首选啮齿动物，部分原因是存在许多代表广泛的自闭症相关基因突变的模型，部分原因是它们体积小且相对便宜。但是，西尔弗曼和首席研究员伦纳德·阿贝杜托在 2012 年开始建立这个实验室，因为他们说大鼠可能是一个更有希望的模型。

小鼠和大鼠在 1200 万至 2400 万年前分化，后者进化得更大、更具社会复杂性。它们的社会行为可以使自闭症的特征——以及性别差异——在测试中更容易被识别出来。

“看到这些家伙了吗？它们在摔跤和玩耍，”西尔弗曼指着一个笼子说，笼子里有几只白色的小大鼠在地板上翻滚，轮流扑到对方的背上。“小鼠永远不会这样做。大鼠更具社交性。”

老鼠也更聪明。以奶昔测试为例：当小鼠进行测试时，它们会用鼻子轻触屏幕上的一个或另一个图像。据西尔弗曼说，老鼠很快就学会了绕过规则，用鼻子和爪子同时敲击两个屏幕，以获得奖励。必须为老鼠提供更高级的版本，其中包括一个小台阶，用于测量爪子的压力，迫使它用鼻子一次选择一个图像。

缺点是老鼠更贵。最初，西尔弗曼和鲍曼计划在他们的初步研究中只使用雄性老鼠，因为包括雌雄两种性别的成本会很高；饲养和喂养一只成年老鼠每天的费用超过一美元。

最终，考虑到美国国立卫生研究院的要求，研究人员决定从一开始就使用雌性和雄性老鼠开始新项目更有意义。西尔弗曼说，这对于理解自闭症模型中的性别差异最终是件好事。“（在小鼠中）没有足够多样化的行为来看到这种差异，”她说。“现在它更接近成为一个现实的可能性，因为我们将获得更大的信号。”

她拉出一个塑料笼子，里面住着一只长着红眼睛的大白鼠，它正在哺乳十几只21天大的幼崽。它们很快就会断奶，并按性别分开放入新的笼子，最终像萨克拉门托的同类小动物一样进行行为和记忆测试。

这项工作在加州大学戴维斯分校和全国其他自闭症实验室的进展情况，只有在研究人员整理出如何包括两种性别并且数据开始涌入时才能逐渐显现。但至少，现在是时候让光滑的白色小鼠和长着红眼睛的大老鼠——以及它们的雌性幼崽——有机会展示它们的实力了。

通过展示自闭症的性别差异如何在最基本的层面上发生，这些动物可能会改变我们对自闭症的根本理解。西尔弗曼认识到新政策将花费更多的钱——但她说这是值得的。“我们应该拥抱美国国立卫生研究院的要求，”她说。“真正重要的是，每一个模型都要分别用雄性和雌性进行研究。”

本文最初于2015年10月19日发表在Spectrum上。在此处查找原始故事。