构建透明大脑

我们的神经系统就像一张挂毯，由相互连接的线编织而成。这些线，即从神经元延伸出的称为轴突的细纤维，将电信息从单个神经细胞传递到接收信号的其他神经元。长程投射轴突，就像纺织品中的结构性“经”线，与大脑自身版本的交叉“纬”线交织在一起：轴突在短距离内来回缠绕，传递信号以执行计算。

为了理解大脑的内部运作，科学家需要解读这种神经挂毯在单个元素层面的组织方式，例如单个轴突。但是，为了理解轴突的作用，我们也希望获得跨越整个大脑的全局视角，并且在某种程度上不会忽视单个线状轴突及其背景。为了获得这样的视角，我们需要一种特殊的工具，因为大脑不像编织布那样是扁平的，也不是透明的。遍布大脑的脂肪分子（脂质），尤其是在细胞膜中，会导致来自成像设备的光散射，从而极大地阻碍我们超越最表层细胞进入大脑深处的视野。

现在，一项新技术为神经科学家开启了令人兴奋的前景，创造了一种观察完整大脑内部的方法，既可以确定轨迹，又可以定义编织穿梭于大脑复杂内部运作的单个连接纤维的分子特性。这种方法建立在水凝胶的化学基础上，水凝胶是一种聚合物，可形成能够保留水分而不会溶解的连通隔室的三维网络。它用于在生物组织内创建3D聚合物内骨骼。在这个三步过程中，首先在实验动物或死后人类大脑本身内形成透明凝胶，该凝胶与大脑的关键信息丰富的分子部分（包括蛋白质和核酸（DNA和RNA））相连，从而起到保护作用。紧随其后的是去除不感兴趣或散射光的组织成分，例如脂质。最后，通过在该结构中引入大量的荧光标记物和其他标记物——除了透明之外，该凝胶还被设计为允许这些探针的快速注入——科学家可以照亮并直接可视化整个完整大脑中各种感兴趣的纤维和分子，并具有非常高的分辨率。

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这种观察人体主控者深处的新能力正在带来许多见解。科学家们正在使用这种方法将物理形式与参与行动和认知的神经通路的生物功能联系起来，范围从运动到记忆。该方法还有助于阐明导致帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、自闭症、药物滥用以及恐惧和焦虑症的过程。我们甚至帮助成立了一家公司，探索组织-水凝胶在癌症诊断中的应用。这种方法现在正被应用于大脑以外的全身各个器官和组织。

变得透明

制造透明大脑非常困难，以至于即使经过数亿年的进化，大型动物的谱系中也未曾实现这一壮举。当然，隐形可以提供巨大的优势，一些物种经过进化选择，具有一定程度的透明度以适应其环境（例如，为了躲避捕食者）。某些鱼类甚至缺乏红色的血红蛋白，基本上放弃了大多数脊椎动物所知的血液，从而实现了一定程度的隐形。然而，即使是这些动物似乎也无法使其中枢神经系统透明，尽管存在巨大的进化压力。在部分透明的鱼类或虾类中，神经系统仍然至少部分不透明；进化甚至可以放弃红细胞，但似乎没有任何东西可以让光线畅通无阻地穿过大型活体大脑。

这种不透明的性质是由于光在神经组织中散射造成的。光子从脂肪和水的界面反弹（因为光在这两种物质中传播速度的差异），并且朝着看似随机的方向（因为神经线路的结构复杂性）。这种效应不容易被轻易地工程化或进化掉。构成细胞膜和脑细胞内部结构的脂质屏障也起着关键作用，作为离子绝缘材料，离子介导沿错综复杂的轴突的电脉冲流动。具有讽刺意味的是，生物学家最需要保持完整以进行理解的器官，也是我们最无法使其透明的器官。

2009年，我转向了使完整、成熟的哺乳动物大脑透明这一尚未解决的挑战——同时仍然允许对内部各种分子进行详细标记。那时，世界各地数百个实验室已经开始使用我和我的同事在2004年至2009年之间开发的一项技术，该技术使用光来关闭和开启特定的脑回路组件。这项称为光遗传学的技术，结合了激光、光纤和来自藻类和细菌的光敏蛋白（称为微生物视蛋白）的基因，以在动物奔跑、跳跃、游泳、社交和执行复杂行为时，精确控制整个活体大脑中特定细胞的神经活动。到2009年夏天，在2004年7月首次使用微生物视蛋白在神经元中进行实验演示五年后，光遗传学的关键挑战已基本解决，该技术可以轻松且普遍地应用。尽管此后通过这种方法发现了数千种关于行为因果神经机制的新见解，但仅光遗传学无法提供另一种关键类型的信息：高分辨率图像，可提供对受光控制的单个细胞的全脑布线的深入了解。

将系统的宏观图景与其单个基本组件联系起来是许多科学领域共同的愿望，尽管这个目标经常（且适当地）被牺牲。将复杂系统的各个部分分离出来进行孤立分析一直是科学必不可少的，因为从上下文中移除组件可以确定哪些属性是内在的，并且不依赖于其他元素。但是对于大脑这样高度互连的结构，将系统拆开，就像分离挂毯的所有线一样，并不总是理解和欣赏宏观图景的最佳策略。

点击或轻触放大

对于可视化和标记，成年哺乳动物大脑的不透明性长期以来决定了必须进行拆卸，通常是通过切片大脑，从而将组织的三维体积变成数百或数千个实际上是二维的切片。这个过程消耗了令人望而却步的时间和费用，特别是当需要许多大脑来产生有意义的统计结果时（这在哺乳动物行为研究中很常见）。此外，关键信息会不可逆转地丢失。因为，通过光遗传学，我们已经在完整的大脑中构建新的功能，所以在2009年，我开始考虑我们还可以在大脑中构建什么来帮助我们解决这个问题。

这个想法的种子早在15年前就种下了。在1990年代中期，我对尝试在实验室中构建类似大脑的回路产生了兴趣，从单个细胞开始。一种方法可能是将神经干细胞播种到聚合物支架上，在那里可以通过生化方法诱导它们转化为神经元。在追求这项努力的过程中，我深入研究了水凝胶的科学和工程文献，水凝胶似乎特别适合作为支架，因为它们具有生物相容性和透明性。

在后来的几年里，我最终只会进行简单的初步实验，将干细胞播种到聚合物支架上并将它们转化为神经元，但我从未达到从单个细胞制造完整的大脑样结构的地步——这是一项极其具有挑战性的任务。尽管如此，当我从一个实验室搬到另一个实验室，并在我的职业生涯中一步步前进时（1998年获得神经科学博士学位，完成精神病学住院医师和博士后研究，并在2004年在斯坦福大学启动我的工程实验室），我还是尽职尽责地拖着我那越来越布满灰尘的文件夹，上面贴着“水凝胶”标签的仔细装订的论文。但是，心理支架已经到位，这个想法扎根并最终发展，在实验室中一些非常有才华的人的关键参与下，成为构建透明且可访问的大脑的可行策略。

2010年2月，在长时间思考全脑可视化问题后，我在办公桌前画了一张草图，描绘了基本思想。这是最初概念的颠倒——我们不是从水凝胶开始并在其中构建大脑，而是从大脑开始并在其中构建水凝胶。水凝胶将充当支撑结构并保留我们关心的脑组件（如蛋白质和核酸）的空间位置，但允许去除所有其他阻止我们深入观察的东西。与此同时，它可以防止大脑在结构性但不太有趣的成分被溶解或消化掉时塌陷成无定形的汤。

最早的实验，跨越了不同的领域，并为原本只是可能的想法带来了初步的雏形，几年后，随着时间的推移带来的广阔视野，才能更好地理解它们。当时在实验室的两名富有创造力和勇气的研究人员——薇薇安娜·格拉迪纳鲁和实验室经理查鲁·拉马克里希南——是第一批愿意承担这个艰巨项目的人。失败的风险太高了，所以我决定不让整个团队参与；我认为这两位经验丰富的研究人员（已经在其他项目中取得了巨大成功）可以应对风险和失望，如果项目最终失败了。

从2010年初开始，格拉迪纳鲁和拉马克里希南试图使神经元免受会破坏精细组织结构和细胞膜的试剂的损害。从理论上讲，用某种耐用聚合物填充脑细胞可能会奏效，如果神经元受到水凝胶的支撑，那么神经元将保持完整。两人尝试了多种策略，包括引入编码某些酶的基因，以允许神经元制造耐久聚合物，如几丁质和纤维素。格拉迪纳鲁的一个创造性想法被证明是最好的方法，即在细胞内部制造另一种生物聚合物角蛋白的过程。她已经证明，培养神经元中的角蛋白可以保护细胞结构免受破坏，并推断对于完整的脑组织（神经元用角蛋白稳定，并添加水凝胶以提供外部支撑），脂质可以用洗涤剂洗掉，以显示悬浮在透明水凝胶中的目标脑结构。

在那时，在完整大脑中构建水凝胶还只是一个纯粹的想法。我决定通过从化学工程师那里寻求更深入的经验来加快项目进度。尽管实验室外没有人知道这个项目，但我还是在我的收件箱中搜索了可能有水凝胶方面合适背景的潜在博士后研究员的电子邮件。当时在佐治亚理工学院的杰出化学工程师邝宏勋的名字出现了。邝宏勋听说过我们的光遗传学和干细胞工作，并有兴趣加入实验室。

2010年3月初，就在我绘制上面插图中显示的原始草图几周后，我在犹他州开会时安排了我们的第一次简短电话交谈。然后我做了一件我以前从未做过（或之后）的事情，因为我非常确信这个新方向。我邀请邝宏勋加入我们的团队，甚至没有进行实验室访问或面对面面试。对于神经科学实验室来说，这是一个奇怪的时期——一位化学工程师不知从哪里冒了出来。

邝宏勋到任后，立即投入到这个秘密项目中。到2010年底，我实验室的三人团队创造出了透明的小鼠大脑块，其中保存的含角蛋白和水凝胶包埋的细胞可以清晰地看到，甚至可以深入组织内部数百微米，这比使用现有方法可能达到的深度要大得多。邝宏勋生产的第一个完全功能的水凝胶是基于丙烯酰胺，丙烯酰胺通常在实验室中用于分离核酸或蛋白质。从这项创造性工作中产生的凝胶-组织混合物被设计为我们可以直接引入荧光标记物和其他标记物，以可视化保存的蛋白质和结构，例如轴突，经过多轮标记，我们发现我们不再需要角蛋白成分来保持细胞结构到位——仅水凝胶就足够了。尽管汉斯-乌尔里希·多特和宫脇敦史（分别是3DISCO和Scale方法）在其他方法方面进行了开创性的工作，但此前尚未在成年哺乳动物大脑中实现如此高的透明度和可及性。

这种特定的基于丙烯酰胺的水凝胶内置组织想法的变体（现在已经有许多其他已发表的变体）被命名为CLARITY（代表clear lipid-exchanged acrylamide-hybridized rigid imaging/immunostaining/in situ hybridization-compatible tissue-hydrogel，即透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶）。自从我们在2013年发表该技术以来，即使是这种单一版本的组织-水凝胶技术也已被用于各种基础科学应用，并已在临床上应用（例如，用于自闭症或阿尔茨海默病患者的死后大脑），以及用于小鼠的脊髓和大脑（例如，在发现以前未知的恐惧和焦虑行为控制通路中）。世界各地实验室的许多论文现在已经发表，使用这种通用方法来理解神经系统的基本结构，通常与光遗传学结合使用，并为理解适应性和适应不良的大脑回路提供新的想法。

正如微生物视蛋白光遗传学的最初五年带来了许多创新，使得该方法得到广泛应用一样，用于构建大脑内部组织-水凝胶的技术在该方法存在的最初几年也取得了巨大的进步。例如，最早版本的水凝胶技术描述了一个步骤，该步骤使用施加的电场来加速快速清除结合到脂质的带电洗涤剂颗粒。这个步骤需要一些练习才能掌握，如果电压调得太高，组织可能会受损。为了解决这个问题，从2014年初开始，当时还是实验室成员的拉朱·托默、布莱恩·许和叶礼发表了两篇论文（一篇与我们在瑞典的同事合著），定义了该步骤的简化版本。它被称为被动CLARITY，因为它不使用电场。托默和团队还描述了使用高分辨率快速光片显微镜的专门大脑-水凝胶成像，该显微镜经过调整以应对快速成像大型水凝胶体积的独特挑战，通过扫描平面（光片）而不是光点。

格拉迪纳鲁和邝宏勋当时都在各自蓬勃发展的实验室工作（分别在加州理工学院和麻省理工学院），各自都在产生重大的新创新。事实上，随后的发展不仅来自他们，也来自许多其他研究人员，进展迅速。格拉迪纳鲁独立开发并发表了一种适用于整个生物体的CLARITY策略，称为PARS。格拉迪纳鲁和邝宏勋都发表了新的水凝胶配方，分别称为PACT和SWITCH，现在世界各地的实验室已经描述了各种各样的组织-水凝胶复合材料。然而，当涉及到实验性地探索可能的水凝胶时，我们才刚刚触及皮毛。2013年，邝宏勋和我公开了一份非常长的可能的水凝胶变体成分清单，从丙烯酸酯到藻酸盐等等，我的实验室和我们的合作者现在正在探索聚合物甚至可以变得活跃的方式——例如，用可以产生可调电导率或化学反应性的元素进行修饰，从而开辟新的可能性。

与组织-水凝胶复合材料的特性相关的另一个挑战是，正如我们在2013年和2014年的论文中描述的那样，它会导致水凝胶包埋的组织物理膨胀相当大。复合材料的这种特性并不总是一个问题，并且可以与高分辨率成像兼容，无论是在原始CLARITY还是在后来的类似脑内水凝胶配方中（每种配方都有其自己的识别首字母缩写：从2014年开始的PACT/ePACT，以及2015年和2016年的ExM/proExM和MAP），这些配方由其他促进基本膨胀效应的组开发。但是，为了能够将我们的透明大脑与学术大脑图谱中的大脑进行比较，这需要精确、未受干扰地再现原始组织，我们开发了最终的可选步骤，用于将扩大的组织缩小回原始大小。

与叶礼和另一位团队成员威尔·艾伦一起，我的实验室还开发并发布了高速和自动化成像和分析软件，任何人都可以下载和使用。我们同事马克·泰西耶-拉维涅（当时在洛克菲勒大学，现在是斯坦福大学校长）的团队也为他们的新iDISCO方法做了同样的事情。这两篇互补的论文于今年在同一期《细胞》杂志上发表。我的团队，包括艾米丽·西尔韦斯特拉克、普里亚·拉贾塞图帕蒂和马修·赖特，也已经能够使用另一种组织-水凝胶配方，在完整的大脑中可靠地进行一次对多种RNA进行至关重要的荧光标记，正如我们早些时候在3月份的《细胞》杂志论文中报道的那样。

标记多种类型分子的能力，包括核酸（如RNA），被证明是水凝胶方法的一个特殊优势，并开辟了基因表达分析的广阔领域。随着所有这些挑战的解决——其中许多挑战仅在今年才解决——该技术现在已经成熟到可以被世界各地的实验室使用。

将线索汇集在一起

回顾过去，将2010年的最初简陋草图与仅仅六年后的完全功能实现和整合进行比较，真是令人瞩目。推动组织-水凝胶愿景发展的关键目标一直是使用完整大脑结构信息来补充完整大脑光遗传学——这个目标已经实现，并在几篇论文中报道过，包括6月16日《细胞》杂志上的一篇论文。该论文中描述的工作重点是大脑的前额叶皮层，该区域负责调节高级认知过程和情绪。科学家们希望，了解这种结构如何控制如此多样化的行为，可能有助于深入了解自闭症和精神分裂症等精神疾病。

与当时在我团队中的叶礼、艾伦和金·汤普森，以及其他实验室的同事，包括斯坦福大学的骆利群和詹妮弗·麦克纳布的实验室，我的团队首先使用光遗传学来定义前额叶皮层中的一个细胞群，该细胞群在奖励性体验（如非常美味的食物甚至可卡因）期间活跃（并且还控制对奖励性体验的适当行为反应）。接下来，我们发现了前额叶细胞的互补群体，用于负面（厌恶）体验。最后，使用我们最新的组织-水凝胶方法，我们能够证明这两个不同的细胞群体在大脑中的布线方式各不相同——阳性群体优先向称为伏隔核的深部大脑结构发送连接，而阴性群体更连接到称为外侧缰核的深部结构。通过这种方式，组织-水凝胶和光遗传学方法使科学家能够以以前不可能的方式研究完整的生物组织，并在理解健康和疾病的基本生物学方面取得进展。

对复杂系统的最充分理解来自于在局部和全局尺度上交换信息的能力，无论所讨论的系统是整个大脑还是复杂的挂毯。在神经科学中，现在可以收集大量数据，其中包含丰富而多样化的细节，阐明完整器官的结构、分子成分和细胞活动。因此，对大脑功能的广泛而细致的视角开始形成。

以局部分辨率实现这种全局视角是困难且不常见的——但迎接这一挑战非常重要。复杂系统的涌现特性通常源于局部相互作用，就像挂毯的编织和科学过程本身一样。只有从广阔的视角来看，每种线的角色才能变得清晰。