150 多年来，科学家们主要依靠化石化的骨骼和牙齿来重建远古时代的生物。骨骼揭示了远古动物的大小和形状；骨骼上的肌肉痕迹表明这些生物有多强壮以及它们可能如何移动；牙齿的形状和磨损证明了所吃食物的种类。总而言之，研究人员已设法从这些坚硬的部分中提取了大量的非凡信息。在极少数情况下，他们偶然发现了保存完好的木乃伊和冰冻的尸体，这使他们能够在重建中添加更多细节，例如皮毛的长度、耳朵的形状、动物最后一餐的具体内容。然而，尽管科学家们已经能够从过去时代的生命形式的物理特征中推断出如此多的东西，但我们对维持它们的生理过程知之甚少。
然而，这种差距正在缩小。生物技术的最新进展现在使我们能够重新组装已灭绝动物的远古基因，并复活这些基因编码的蛋白质——这些蛋白质既形成又驱动着生命过程的细胞机制。这项工作预示着一门激动人心的新兴科学学科的曙光：古生理学，即研究过去生物的身体在生命中如何运作。我们仍处于这项研究的早期阶段，但我们已经对史前时代的一个标志性野兽——猛犸象——如何适应冰河时代世界的残酷条件有了惊人的见解。尽管克隆史前动物的侏罗纪公园梦想仍然遥不可及，但我们的工作已经证明了观察发生在早已从地球表面消失的生物体内的关键生理过程的可行性。
悬案
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对于我们中的一位（坎贝尔）来说，这项事业的灵感始于 2001 年的一个晚上，当时他正在观看一个电视节目，记录从西伯利亚永久冻土中挖掘猛犸象遗骸的过程。鉴于 1997 年宣布克隆绵羊多莉的事件广为人知，节目中的专家推测——事实证明是错误的——来自这只猛犸象的 DNA 可能很快就能让科学家们让这些生物重获新生。坎贝尔自己的愿景比这项极其复杂的企业更具针对性，并且最终更可行。他想弄清楚这些现今亚洲象的已灭绝近亲是如何适应它们居住的高纬度地区的寒冷气候的。
化石记录表明，猛犸象的祖先起源于非洲的亚热带平原，直到不到两百万年前才迁徙到西伯利亚，当时地球正进入其历史上最深刻的降温事件之一：更新世冰期。与非洲象一样，猛犸象祖先在其家园面临的主要生理挑战将是避免过热。然而，一旦该谱系向北迁徙，世界变冷，保持体温就变得至关重要。
由于我们对已灭绝物种生物学的所有了解几乎都是从对其化石化、冰冻或木乃伊化的遗骸的详细研究中推断出来的，因此关于猛犸象适应寒冷的讨论主要局限于从回收的尸体中直接可观察到的物理属性，例如这些猛犸象因此得名的浓密羊毛底毛。然而，物理特征只是故事的一部分——而且可能只是次要的一部分。事实上，一系列生理过程无疑对于它们在寒冷中生存至关重要。不幸的是，这些过程在化石记录中没有留下痕迹，因此我们研究它们的唯一希望是从远古遗骸中回收破碎的 DNA 片段，将基因完整地拼凑在一起，将它们插入活细胞中，并诱导细胞重新创造曾经控制这些过程的蛋白质。然后，我们可以精确地观察已灭绝动物的蛋白质与它们现存的近亲相比是如何发挥作用的。
因此，坎贝尔使用保存完好的 DNA 研究猛犸象适应寒冷的想法，虽然比实际复活这些野兽简单几个数量级，但仍然需要大量的精巧生物技术工作。幸运的是，远古 DNA 研究的重大进展即将到来，这将有助于为实现他的目标铺平道路。
即使在最好的情况下，长期死亡标本中的 DNA（如果已保存下来）也以极小的量存在。它也高度片段化且布满化学损伤。活生物体的细胞包含两种 DNA：细胞能量产生细胞器或线粒体中的简单 DNA 环，以及细胞核中更复杂的 DNA。早期对远古 DNA 的研究集中在线粒体变体上，因为它比核 DNA 丰富得多：每个细胞都有数百个线粒体，但只有一个细胞核。然而，线粒体 DNA 仅占细胞中所有遗传物质的极小一部分；它仅编码少数蛋白质，所有蛋白质仅在线粒体中使用。真正的作用在于核 DNA。科学家最初认为，不可能回收足够的远古核 DNA 来进行研究。然而，1999 年，现在在柏林莱布尼茨动物园和野生动物研究所的亚历克斯·格林伍德和他的同事报告说，他们在永久冻土遗骸中发现了证据，表明核 DNA 的小片段可以在数万年内以足以进行分析的量存活。
尽管格林伍德的工作证明了从与猛犸象一样古老的生物中获得核序列的短片段（即包含多达 70 个核苷酸——遗传密码的“字母”）是可能的，但对构成每个完整基因的数百到数千个核苷酸进行测序仍然在很大程度上是不切实际的。此外，格林伍德的方法需要破坏大量来之不易的远古 DNA。然而，通过借用分子生物学家用来从现存生物体中生成 DNA 多个拷贝的称为多重 PCR 的技术，我们中的一位（霍夫莱特）提出了解决这些问题的方法，从而扫清了研究已灭绝生物体生理学的关键障碍。在他的第一个原理验证中，他的研究团队从冰河时代物种——猛犸象——组装了第一个完整的线粒体基因组（一个 16,500 个核苷酸的序列），并在 2005 年发表了这一发现。
金发女郎和红发女郎
在磨练了其远古 DNA 测序技术后，霍夫莱特的德国莱比锡团队随后使用该技术重建了来自已灭绝物种的第一个完整核基因。DNA 的来源再次是一只猛犸象，具体来说是哥本哈根大学的埃斯克·威勒斯列夫在西伯利亚北部发现的一块保存异常完好的 43,000 年历史的股骨。该团队选择了一个名为黑素皮质素 1 受体 (MC1R) 的基因，已知该基因有助于确定鸟类羽毛和哺乳动物毛发的颜色。MC1R 很有吸引力，因为它很短且易于插入细胞中，在细胞中可以测量其分子活性，使研究人员能够将 DNA 序列与可观察到的性状联系起来。
鉴于从永久冻土保存的猛犸象中回收的毛发往往呈浅色或深色，霍夫莱特和他的合作者推测，基因功能的差异——而不是毛发暴露于数万年的沉积物中的化学因素——可能构成了这两种不同毛发颜色的基础。对构成完整 MC1R 基因的所有 1,236 个核苷酸进行测序，揭示了两个独立的基因变体或等位基因。第一个等位基因与相应的非洲象基因在一个核苷酸上不同，而第二个等位基因包含三个额外的突变，所有这些突变都在产生的蛋白质中产生了氨基酸（蛋白质的组成部分）的取代。
尽管霍夫莱特和他的合作者很感兴趣地发现，这些取代中的两个发生在蛋白质中在进化过程中很少发生变化的位置，但在其他哺乳动物中缺乏可比的突变使得不可能衡量这些不寻常的替换是否影响了猛犸象的毛发颜色。然而，对细胞中基因活性的分析表明，第二个等位基因中的三个突变之一产生了取代，从而使色素沉着基因的活性降低。从其他哺乳动物色素沉着基因的分子活性来判断，这种较弱的变体可能有助于使一些猛犸象的皮毛变成金色。
非常巧合的是，当时在加州大学圣地亚哥分校的霍皮·霍克斯特拉和她的同事同时发现，一些现代沙滩鼠种群携带一种 MC1R 基因变体，该变体产生与第二个猛犸象等位基因中发现的相同的关键氨基酸交换。更重要的是，携带这种变体的小鼠具有浅色皮毛，这为它们栖息的沙质环境提供了天然伪装。对于猛犸象来说，成为金发女郎的好处远没有那么明显，因为金发个体在原始西伯利亚的无树景观中仍然会非常显眼。然而，可以想象的是，浅色的皮毛有助于这些动物在这个寒冷多风的环境中保持温暖，正如对具有浅色的现存鸟类和哺乳动物所表明的那样。这听起来可能违反直觉，因为浅色毛发会反射大量太阳辐射，但这种毛发也会将一些入射辐射散射到皮肤，在那里它被吸收为热量。相比之下，深色皮毛在其外表面吸收太阳辐射，风会迅速消散其提供的热量。
在成功重建猛犸象的远古核基因后，霍夫莱特小组将注意力转向尼安德特人，尼安德特人是 智人 的近亲，生活在欧亚大陆，大约在 28,000 年前灭绝。该团队获得了 MC1R 基因的 128 个核苷酸片段，该片段编码了今天人类中未见的氨基酸取代。与猛犸象等位基因一样，功能分析表明，这种单一变化使蛋白质的活性低于标准人类版本。鉴于功能相似降低的 MC1R 基因变体出现在现代欧洲血统的人类中，他们有红头发和白皙的皮肤，我们推测一些尼安德特人也可能拥有红头发和白皙的皮肤（尽管是由于蛋白质活性具有相似影响的不同突变）。在尼安德特人居住的高纬度地区，合成维生素 D 所需的紫外线供应不足。浅色可能有助于尼安德特人吸收足够的紫外线，紫外线不太容易穿透深色皮肤。
这些开创性的研究明确地表明，可观察性状的基因重建现在已经成为现实。我们现在准备使用这种强大的新工具来追踪已灭绝物种的生命过程——真正的古生理学。
当血液变冷时
今天，所有适应寒冷的大型哺乳动物——从驯鹿到麝牛——都拥有一套紧密排列的动脉和静脉系统，这些动脉和静脉沿着四肢和末端彼此反向平行地延伸。这种排列被称为 rete mirabile，或“奇妙的网络”，形成了一种高效的逆流热交换器，其中离开身体核心的温暖、含氧动脉血将其大部分热量传递给流向心脏的寒冷静脉血。由此产生的温差使与寒冷表面（如脚垫）接触的末端温度保持在略高于冰点的水平，从而大大减少了整体热量损失。这些热量节省意味着保持温暖所需的卡路里更少，从而在冬季为北极物种提供了至关重要的优势，因为冬季通常很难获得卡路里。矛盾的是，这种解剖学适应性剥夺了末端确保血红蛋白正常运作所需的热能。在脊椎动物中，红细胞蛋白血红蛋白从肺部收集氧气，然后将其输送到组织。然而，打破血红蛋白和氧气之间微弱的化学键需要能量，因此血红蛋白向组织输送氧气的能力会随着温度的下降而骤降。
为了弥补这一缺点，耐寒哺乳动物的血红蛋白需要补充热源。尽管人们对这种性状背后的精确分子机制尚不清楚，但它们通常似乎涉及血液细胞内部的其他分子与血红蛋白的结合。这些分子与血红蛋白之间化学键的形成释放出热能，这些热能可以捐献出来帮助血红蛋白将氧气释放到组织中。
坎贝尔的团队——直到那时还独立于霍夫莱特团队工作——假设猛犸象血红蛋白也进化出了有助于在寒冷中释放氧气的变化。对猛犸象血红蛋白基因进行测序，并将这些序列与亚洲象血红蛋白基因的序列进行比较，大概可以揭示是否发生了这种变化以及它们是什么。
早期与澳大利亚阿德莱德大学的艾伦·库珀合作对产生形成血红蛋白骨架的不同所谓珠蛋白链蛋白的两个猛犸象基因进行测序的尝试遇到了重大挫折：大多数可用的猛犸象样本质量都不够高，无法获得可用的 DNA 片段。在这一点上，坎贝尔和库珀的团队与霍夫莱特的团队联手，并使用参与 MC1R 研究的相同 DNA 提取物，我们很快获得了两个猛犸象血红蛋白基因的完整编码序列，从而了解了珠蛋白链的氨基酸序列。
最初的 DNA 测序结果显示，猛犸象珠蛋白链之一与亚洲象在 146 个氨基酸位置中的 3 个位置不同——这一发现很快成为令人兴奋的来源，因为我们确信这三个氨基酸取代包含了适应寒冷的生理学的清晰遗传特征。对这一假设的初步支持来自一种罕见的人类血红蛋白变体，称为 Rush 血红蛋白，它携带猛犸象序列中发现的突变之一。尽管 Rush 蛋白仅在一个氨基酸位置上与正常人血蛋白不同，但这种差异从根本上改变了血红蛋白的生化特性，从而显着降低了其温度敏感性，因此使其能够在寒冷中更轻松地释放氧气，就像适应寒冷的哺乳动物的血红蛋白一样。
建立猛犸象血红蛋白中明显的变化是对寒冷气候的适应的下一步是复活远古血红蛋白并观察其作用。为了复制猛犸象血红蛋白组分的基因，我们从亚洲象血液中获得了完整的血红蛋白基因，并在三个突变位点对其进行了改造，以匹配猛犸象序列。然后，我们将产生的类似猛犸象的基因插入大肠杆菌细菌中，欺骗它们组装出与曾经在提供 DNA 的 43,000 年历史的标本血液中循环的猛犸象血红蛋白在形式和功能上无法区分的猛犸象血红蛋白。
历史上，我们第一次能够以与研究现代动物的生理过程完全相同的方式分析已灭绝物种的重要生理过程。我们仔细测量了猛犸象和亚洲象血红蛋白在模拟红细胞内部化学环境的溶液中在各种生理相关温度下结合和释放氧气的能力。正如 Rush 血红蛋白研究预测的那样，猛犸象蛋白质在寒冷温度下确实比亚洲象血红蛋白更容易释放氧气（两种血红蛋白在 37 摄氏度左右的正常核心体温下功能相同）。有趣的是，猛犸象血红蛋白结合其他分子并因此产生输送其氧气有效载荷所需的补充热源的能力，是由与现代北极哺乳动物血红蛋白中发现的完全不同的遗传变化引起的，正如猛犸象血红蛋白基因序列与现代对应物的序列比较所示。值得一提的是，虽然猛犸象突变是适应耐寒性的，但人类 Rush 变体并非如此，因为它会破坏蛋白质的稳定性，从而使携带者长期贫血。为什么这种不良特性会出现在人类血红蛋白中，而不是猛犸象血红蛋白中，这个问题仍然需要解答。
饲养猛犸象？
当然，血红蛋白适应性只是猛犸象如何适应寒冷生活的一个难题；这些动物的许多其他生化适应性，更不用说其他数十种已灭绝物种的生化适应性，仍有待阐明。不幸的是，科学家近年来测序的大量远古基因组不太可能在这方面提供太多帮助，因为用于获得它们的所谓鸟枪法测序技术产生了一系列随机序列，这些序列虽然对于宏观评估很有用，但通常不够准确或完整，无法提供生理学见解，除非测序重复多次以至于成本相对过高。
一种称为杂交捕获的新方法以更低的成本生成目标基因的更深覆盖率，因此可以解决该问题，从而可以进行大规模研究，比较例如来自相对温暖的间冰期的西伯利亚猛犸象与来自冰川最厚时期的寒冷冰期最大期的重要基因网络。杂交捕获还可以使研究人员能够比较同一物种的地理位置分散的种群——例如西伯利亚和西班牙猛犸象。此类研究不仅可以评估物种内的遗传变异性，还可以深入了解针对当地地理和气候条件的新型生理适应性。尽管这些未来前景令人兴奋（想象一下 50,000 年的进化在你眼前展开），但我们分析古生理学的能力在某种程度上受到限制。理想情况下，我们会在体内研究已灭绝的蛋白质，因为蛋白质的许多特性只有在活生物体中才能显现出来。然而，此类研究不太可能很快发生，因为它们需要重建已灭绝的物种。
目前，我们将不得不满足于在试管和细胞培养物中观察远古蛋白质。我们已经在使用这些技术来探索其他已消失生物的生理学——其中包括乳齿象和一种最近灭绝的北极海洋哺乳动物，即斯特拉海牛。克隆这些动物的极其复杂的可能性在可预见的未来仍将停留在幻想领域。与此同时，我们将继续一次呼吸一口远古蛋白质，为这些早已死去的野兽注入生命。