蝾螈的肢体比大多数人的肢体要小一些，也更黏糊糊一些，但在其他方面，它们与人类的肢体并没有太大的不同。蝾螈的肢体包裹在皮肤中，内部由骨骼、肌肉、韧带、肌腱、神经和血管组成。一种被称为成纤维细胞的松散排列的细胞将所有这些内部组织结合在一起，并赋予肢体形状。
然而，蝾螈的肢体在脊椎动物世界中是独一无二的，因为它可以在截肢后从残肢上再生。成年蝾螈可以一次又一次地再生失去的手臂或腿，无论该部位被截肢多少次。青蛙在蝌蚪阶段，当它们的肢体刚开始长出时，可以重建肢体，但它们在成年后会失去这种能力。甚至哺乳动物的胚胎也具有一定的替代发育肢芽的能力，但这种能力也在出生前很久就消失了。事实上，这种在生物体发育过程中再生能力下降的趋势反映在更高等动物形式的进化中，使得低等的蝾螈成为唯一一种仍然能够在整个生命周期中再生复杂身体部位的脊椎动物。
长期以来，人类一直想知道蝾螈是如何完成这一壮举的。肢体再生部分如何“知道”缺失了多少肢体需要被替换？为什么残肢处的皮肤不会像人类那样形成疤痕来封闭伤口？成年蝾螈的组织如何能够保留胚胎的潜力，从而多次从零开始构建整个肢体？生物学家们正在逐渐接近这些问题的答案。如果我们能够理解自然界中的再生过程是如何运作的，我们希望能够触发人类的再生过程，例如再生截肢的肢体，并彻底改变其他严重伤口的愈合方式。
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人体对如此严重损伤的最初反应与蝾螈的反应并没有太大的不同，但不久之后，人类和两栖动物的伤口愈合策略就出现了分歧。我们的策略导致疤痕，相当于再生反应的失败，但一些迹象表明，人类确实具有重建复杂部位的潜力。实现这一目标的关键将是挖掘我们潜在的能力，使我们自身的伤口愈合变得更像蝾螈。因此，我们的研究首先侧重于向专家学习如何做到这一点。
来自蝾螈的经验
当微小的蝾螈肢体被截肢时，剩余残肢中的血管会迅速收缩，因此出血受到限制，皮肤细胞层迅速覆盖截肢部位的表面。在受伤后的最初几天，这种所谓的伤口表皮会转变为一层称为顶端上皮帽 (AEC) 的信号细胞，这对于成功再生至关重要。与此同时，成纤维细胞从结缔组织网中脱离出来，并迁移穿过截肢表面，在伤口中心汇合。它们在那里增殖形成芽基——一种干细胞聚集体，将作为新肢体的前体。
多年前，我们在加州大学欧文分校的同事 Susan V. Bryant 的实验室进行的研究表明，芽基中的细胞相当于蝾螈胚胎发育肢芽中的细胞。这一发现表明，芽基构建肢体本质上是对动物原始发育过程中肢体形成的概括。这一见解的一个重要含义是，相同的遗传程序参与了这两种情况，并且由于人类在胚胎时期会制造肢体，原则上我们应该已经拥有在成年后再生肢体的必要程序。因此，科学家们似乎需要做的就是弄清楚如何诱导截肢的肢体形成芽基。
我们中的一位（Gardiner）——几年前与加州大学欧文分校的 Tetsuya Endo 合作——采取了一种极简主义的方法来回答如何制造芽基的基本问题。我们没有研究蝾螈截肢部位（芽基会在那里自然形成），而是观察蝾螈肢体侧面的简单伤口，这些伤口通常只会通过再生皮肤来愈合。我们的想法是，这种伤口类似于未能再生新肢体的哺乳动物截肢肢体的部位。如果我们可以让整个肢体在通常发生简单伤口愈合反应的地方生长，那么我们可以进一步剖析再生过程。
在我们对蝾螈腿部做一个小切口后，表皮细胞迁移以覆盖和封闭伤口，就像在截肢部位一样，来自皮肤真皮层的成纤维细胞也移动进来以替换缺失的皮肤。但是，如果我们小心地将神经转移到伤口部位，我们可以诱导这些成纤维细胞形成芽基。凯斯西储大学的 Marcus Singer 在半个多世纪前就已证明神经支配对于再生反应是必需的，但我们的实验澄清了神经提供的未知因子通过改变常驻成纤维细胞的行为来影响再生。
然而，这些诱导的芽基从未发展到再生的后期阶段以形成新的肢体。还需要一种成分。诱导产生新肢体的芽基的关键是将肢体另一侧的一块皮肤移植到伤口部位，这使得来自肢体相反区域的成纤维细胞能够参与愈合反应。由此产生的附属肢体当然是在异常位置长出的，但它在解剖学上是正常的。因此，制造芽基的基本配方似乎相对简单：您需要伤口表皮、神经和来自肢体相反两侧的成纤维细胞。考虑到肢体再生的这种极简主义观点，我们开始专注于理解各个成分的作用。
我们知道，表皮来源于早期发育胚胎中三个原始细胞层之一的外胚层，外胚层也因提供控制肢芽上肢体向外生长的信号而闻名。外胚层细胞聚集在芽中形成顶端外胚层脊 (AER)，它暂时产生化学信号，引导下方肢芽细胞的迁移和增殖。
虽然来自表皮的一些关键信号尚未被识别，但成纤维细胞生长因子 (FGF) 家族的成员参与其中。AER 产生许多 FGF，刺激肢芽的下方细胞产生其他 FGF，从而推动 AER 和肢芽细胞之间信号反馈回路，这对于肢体的向外生长至关重要。人们认为，AEC 激发的类似反馈回路在肢体再生过程中以相同方式发挥作用，日本东北大学的井出博之 (Hiroyuki Ide) 发现，青蛙蝌蚪再生能力逐渐丧失与 FGF 回路激活失败有关。通过用 FGF10 处理较老的非再生蝌蚪肢体，他能够启动该信号回路并刺激截肢肢体的部分再生。
然而，这一结果激发的兴奋感被以下事实所缓和：诱导的再生体是不正常的，由不规则放置的肢体部分组成，这提出了一个重要问题，即如何控制再生，以便准确地替换截肢时丢失的所有适当的解剖结构。事实证明，另一个主要的细胞参与者，成纤维细胞，执行此功能。
位置，位置，位置
回想一下极简主义附属肢体实验，成纤维细胞本身的存在不足以进行再生，因为在不产生新肢体的简单伤口部位存在成纤维细胞。事实证明，来自肢体另一侧的成纤维细胞至关重要。这一发现说明了细胞位置在触发再生反应中的重要性。在胚胎中，肢体发育中的事件顺序总是从肢体基部（肩部或髋部）的形成开始，然后逐步构建更远端的结构，直到该过程以手指或脚趾的形成为止。另一方面，在蝾螈再生中（或脚），截肢部位可能位于肢体长度的任何位置，并且无论伤口位于何处，都只会再生截肢的肢体部分。
这种可变反应表明，截肢伤口边缘的细胞必须“知道”它们相对于整个肢体的位置。这种位置信息控制着导致完美替换缺失肢体部分的细胞和分子过程，并且它被编码在各种基因的活动中。检查在这些过程中哪些基因在起作用有助于揭示控制再生这一阶段的机制。
虽然在胚胎发育过程中有大量基因参与指导细胞了解它们在肢体中的位置，但称为 Hox 的基因家族的活动至关重要。在大多数动物中，发育中的肢芽中的细胞使用 Hox 基因提供的位置代码来形成肢体，但随后当它们分化成更专业的组织后，它们会“忘记”它们来自哪里。相比之下，成年蝾螈肢体中的成纤维细胞保留了此信息系统的记忆，并且可以在肢体再生过程中重新访问位置 Hox 代码。
在再生过程中，成纤维细胞在迁移穿过伤口以启动芽基形成时，会将此信息随身携带，一旦进入芽基，细胞就能够“相互交谈”以评估损伤程度。这种串扰的内容在很大程度上仍然是一个谜，但我们确实知道，对话的一个结果是，再生的肢体首先建立其边界，包括手或脚的轮廓，以便细胞可以使用其位置信息来填充截肢平面和手指或脚趾之间的缺失部分。
由于肌肉和骨骼构成了肢体的大部分，我们也对这些组织的原始材料来自何处以及控制其形成的机制感兴趣。当再生反应启动时，关键的早期事件之一涉及一个知之甚少的称为去分化的过程。该术语通常用于描述细胞从成熟的专门状态逆转为更原始的胚胎状态，这使其能够繁殖并充当一种或多种组织类型的前体。
在再生领域，早期科学家首次使用该词，他们在显微镜下观察到蝾螈残肢组织，特别是肌肉，似乎分解并产生增殖细胞，形成芽基。我们现在知道，这些与肌肉相关的细胞来源于通常存在于肌肉组织中的干细胞，而不是来自肌肉的去分化。在再生肢体中的每种组织类型的情况下，去分化是否真的发生还有待证明，尽管很明显，这种主题的变体确实在再生过程中发生。进入芽基并变成原始芽基细胞的成纤维细胞具有分化成骨骼组织（骨骼和软骨）的能力，以及例如再分化成将形成新肢体间质网的成纤维细胞。
回到芽基形成中另一个核心细胞参与者，表皮细胞，我们还可以精确定位再生过程中似乎这些细胞正在向更胚胎状态转变的时刻。许多在胚胎外胚层中活跃的基因对于肢体发育至关重要，包括 Fgf8 和 Wnt7a，但随着胚胎外胚层分化形成成人的多层表皮，这些基因被关闭。在成人的再生过程中，迁移穿过截肢伤口并建立伤口表皮的表皮细胞最初开始显示基因活性，例如产生与再生没有特定关系的伤口愈合角蛋白。稍后，伤口表皮细胞会激活 Fgf8 和 Wnt7a 这两个重要的发育基因。因此，出于实际目的，去分化的基本定义——因为它与表皮和其他细胞类型有关——是基本发育基因的特定重新激活。
因此，我们对蝾螈的研究表明，再生过程可以分为关键阶段，从伤口愈合反应开始，然后是由在某种程度上恢复到胚胎状态的细胞形成芽基，最后，启动发育程序以构建新的肢体。当我们朝着诱导人类肢体再生的挑战迈进时，我们依靠这些见解来指导我们的努力。事实上，科学中最难发现的事情是那些尚未发生的事情，而人类的肢体再生恰好属于这一类，尽管这并不意味着人类没有自然的再生能力。
指尖的潜力
人类肢体再生是一个可行的目标，最令人鼓舞的迹象之一是我们的指尖已经具有内在的再生能力。这一观察结果首先在 30 多年前的幼儿中被发现，但此后在青少年甚至成人中也报告了类似的发现。促进指尖截肢损伤的再生显然就像清洁伤口并用简单的敷料覆盖伤口一样简单。如果允许自然愈合，指尖会恢复其轮廓、指纹和感觉，并经历不同程度的延长。医学期刊已数千次记录了这种指尖截肢损伤保守治疗的成功案例。有趣的是，此类损伤的替代方案通常包括手术缝合皮肤瓣覆盖截肢伤口，这种“治疗”我们现在知道即使在蝾螈中也会抑制再生，因为它会干扰伤口表皮的形成。这些报告中蕴含的深刻信息是，人类具有固有的再生能力，可悲的是，这种能力已被我们自己的一些传统医疗实践所抑制。
研究自然的人类指尖再生是如何运作的并不容易，因为我们不能随意截肢手指来进行实验，但几位研究人员已在幼鼠和成年小鼠中证明了相同的反应。近年来，我们中的两人（Muneoka 和 Han）一直在更详细地研究小鼠指尖再生反应。我们已经确定，指尖截肢后确实会形成伤口表皮，但它覆盖再生伤口的速度比蝾螈慢得多。我们还表明，在指尖再生过程中，重要的胚胎基因在伤口部位未分化、增殖的细胞群中活跃，表明它们是芽基细胞。间接证据表明，它们来源于存在于间质结缔组织和骨髓中的成纤维细胞。
为了探索特定基因和生长因子在小鼠指尖再生反应中的作用，我们开发了一种组织培养，作为胎儿小鼠指尖再生的模型。通过它，我们发现，如果我们实验性地从胎儿截肢伤口中去除一种称为骨形态发生蛋白 4 (BMP4) 的生长因子，我们会抑制再生。此外，我们已经证明，缺乏一种名为 Msx1 基因的突变小鼠无法再生其指尖。在胎儿指尖中，Msx1 对于 BMP4 的产生至关重要，我们能够通过在 Msx1 缺陷小鼠的伤口中添加 BMP4 来恢复再生反应，从而证实了 BMP4 对于再生的必要性。
Cory Abate-Shen 及其在罗伯特·伍德·约翰逊医学院的同事的研究也表明，Msx1 编码的蛋白质在胚胎发育过程中抑制多种细胞类型的分化。这种与分化控制的联系表明，该蛋白质通过引起细胞去分化在再生反应中发挥作用。虽然 Msx1 在蝾螈肢体再生的早期去分化阶段不活跃，但它的姊妹基因 Msx2 是再生过程中最早重新激活的基因之一，并且很可能具有相似的功能。
人类挑战 让人类肢体再生的想法可能仍然更像是幻想而不是一种可行的可能性，但凭借我们一直在描述的这些见解，我们可以以逻辑的逐步方式评估它可能如何发生。截肢的人类肢体会导致一个大而复杂的伤口表面，该表面横切许多不同的组织，包括表皮、真皮和间质结缔组织、脂肪组织、肌肉、骨骼、神经和血管系统。单独观察这些不同的组织类型，我们发现其中大多数实际上都非常能够再生小规模损伤。
事实上，肢体中唯一缺乏再生能力的组织类型是真皮，真皮由异质细胞群组成，其中许多是成纤维细胞——与蝾螈再生反应中起着如此关键作用的细胞相同。在人类和其他哺乳动物受伤后，这些细胞会经历一个称为纤维化的过程，该过程通过沉积无组织的细胞外基质材料网络来“愈合”伤口，最终形成疤痕组织。蝾螈再生和哺乳动物再生失败之间最显着的区别在于，哺乳动物成纤维细胞形成疤痕，而蝾螈成纤维细胞不形成疤痕。哺乳动物的这种纤维化反应不仅会阻碍再生，而且本身可能是一个非常严重的医疗问题，它会永久性和渐进性地损害许多器官（如肝脏和心脏）在损伤或疾病后的功能。
对深层伤口的研究表明，至少有两类成纤维细胞在愈合过程中侵入伤口。其中一些细胞是存在于真皮中的成纤维细胞，另一些细胞来源于循环的成纤维细胞样干细胞。这两种类型都被也涌向现场的免疫细胞的信号所吸引。一旦进入伤口，成纤维细胞就会迁移和增殖，最终产生和修饰该区域的细胞外基质。这个早期过程与蝾螈伤口中的再生反应并没有太大的不同，但哺乳动物成纤维细胞会产生过量的基质，这些基质在疤痕组织成熟时会异常交联。相比之下，蝾螈成纤维细胞一旦正常结构恢复，就会停止产生基质。
然而，哺乳动物中确实存在这种模式的例外。胎儿皮肤中的伤口愈合时不会形成疤痕——产生完美的皮肤再生，表明向纤维化反应的转变随着皮肤的发育成熟而出现。虽然这种差异可能反映了成纤维细胞生物学的变化，但更有可能是细胞外伤口环境改变的信号调节成纤维细胞行为的结果，这反过来表明，治疗性地修饰这些信号可能会改变愈合反应。与此同时，肢体在胎儿发育阶段截肢不会导致肢体再生的事实提醒我们，无疤痕伤口愈合可能是再生的必要条件，但并非充分条件。
为了增进我们对诱导人类肢体再生所需的条件的理解，我们正在继续我们的小鼠研究工作。我们的研究小组已经描述了小鼠截肢损伤中的自然芽基，我们未来一年的目标是在通常不会发生芽基的地方诱导芽基。就像蝾螈的附属肢体实验一样，这一成就将确立芽基形成的最基本要求。我们希望这一研究方向也能揭示，正如我们所怀疑的那样，芽基本身是否提供防止伤口部位纤维化的关键信号。
如果我们成功地在哺乳动物中产生芽基，那么我们面临的下一个巨大障碍将是诱导指截肢部位再生整个手指。这项任务的复杂性比再生简单的指尖要高出许多倍，因为整个手指包括关节，关节是胚胎发育过程中身体中形成的最复杂的骨骼结构之一。发育生物学家仍在努力理解关节是如何自然形成的，因此构建再生的鼠标手指（包括关节）将是再生领域的一个重要里程碑。我们希望在未来几年内实现这一目标，在那之后，再生整个鼠标爪，然后是手臂的前景将不会显得那么遥远。
事实上，当我们考虑到我们从各种动物模型的研究中学到的所有关于伤口愈合和再生的知识时，令人惊讶的结论是，我们可能只需要一二十年就可以迎来我们可以再生人体部位的那一天。蝾螈成纤维细胞在指导再生反应中的行为与哺乳动物中导致疤痕形成的纤维化反应之间的鲜明对比表明，通往成功再生的道路上布满了这些细胞。同样令人鼓舞的是，斯坦福大学的 Howard Y. Chang 和 John L. Rinn 最近发现，成年人类成纤维细胞与蝾螈成纤维细胞一样，保留了用于在胚胎早期发育身体计划的空间坐标系统的记忆。鉴于这种位置信息是蝾螈再生所必需的，它在人类成纤维细胞中的存在增强了利用和激活再生所需的发育程序的可行性。
现在，当我们观看蝾螈长回手臂时，我们不再像以前那样对它的发生方式感到困惑。很快，人类也许能够亲自利用这种真正令人敬畏的能力，随意更换受损和患病的身体部位，也许是无限期地更换。